研究背景骨质疏松症(osteoporosis,OP)是一种以骨密度降低、骨组织微结构退化为特征、导致骨骼脆性增加而易引发骨折的全身性骨代谢疾病,主要表现为腰背部疼痛、身长缩短、骨折、驼背、呼吸功能受限以及骨密度下降等。OP发病率高,病程长,可不同程度影响患者生活质量,特别是由其引发的各类骨质疏松性骨折,常给患者带来致命性灾难。OP是目前影响人类健康的主要疾病之一,同时给社会造成了巨大的经济负担,已成为重要的公共健康问题。老年性骨质疏松症(Senile Osteoporosis,SOP)又称为Ⅱ型骨质疏松症,是原发性骨质疏松症的重要类型。随着人均寿命的延长特别是近年来人口老龄化进程的不断加剧,SOP患者人数在整个骨质疏松症人群中所占的比例不断上升,使得近年来各类骨质疏松性骨折的发生率明显升高。据统计,即使保持年龄因素对引发髋部骨折结局的影响强度不变,世界范围内发生髋部骨折的人数将从1990年的170万上升至2050年的630万。因此,如何有效应对SOP在整个OP的防控工作中具有越来越重要的意义。近几十年来国内外在妇女绝经后骨质疏松症(Postmenopausal Osteoporosis,PMO)方面进行了大量深入细致的研究工作,取得了可喜成绩。而相比之下,对SOP的研究却未得到足够重视。目前,针对SOP的治疗方法很多,但其有效性及安全性噬待提高。因此,研究SOP的发生发展机制、探索防治SOP的新途径,具有极其重要的社会意义。人体内氧化还原反应失衡导致活性氧类物质(Reactive Oxygen Species, ROS)积聚,引发氧化应激。在氧化应激状态下,大分子结构物质如蛋白质、脂质、DNA/RNA等易遭受氧化损伤而丧失正产的结构和功能,其中蛋白质是氧化损伤的主要原初靶。晚期氧化蛋白产物(Advanced Oxidation Protein Products, AOPPs)就是体内蛋白质特别是白蛋白在氧化应激状态下经氧化修饰生成的一类双酪氨酸蛋白交联物,最早由Witko-Sarsat等在行血液透析的尿毒症患者血浆中发现。AOPPs也可在体外通过血浆或纯化的血清白蛋白与次氯酸混合反应而生成,其生成浓度与加入的次氯酸呈剂量依赖性关系。双酪氨酸是蛋白质被氧化后的的特征性结构,Horie等发现人体血浆中AOPPs浓度与双酪氨酸及蛋白质糖基化标志物戊糖苷浓度呈正比,因此,AOPPs是氧化应激的良好标志物。近十几年的研究发现,除尿毒症外,AOPPs的蓄积与人类多种疾病有关。Piwowar等发现2型糖尿病患者血浆AOPPs浓度明显较正常人高,并与体内氧化及抗氧化标记物浓度呈相关性,而有微血管病变的糖尿病患者血浆AOPPs浓度也明显高于无病变患者。慢性肾脏疾病(Chronic Kidney Disease, CKD)患者早期血浆AOPPs即显著升高,并随着肾功能恶化而进行性升高。AOPPs与动脉粥样硬化关系密切。Witko-Sarsat等对血液透析患者的研究发现该类患者血浆AOPPs浓度与颈动脉内膜中层厚度呈明显的相关性。Kaneda等针对冠心病人群进行的一项研究发现,冠心病患者血液中AOPPs浓度明显较正常人高,并与冠心病的严重程度相关,是冠心病的一个独立危险因素。Barsotti等还发现冠心病病人血浆AOPPs/巯基比例明显升高,并认为AOPPs/巯基比例升高可作为急性冠脉综合征发作的标志。既往文献报道的存在AOPPs蓄积的疾病还有IgA肾病、过敏性紫癜、过敏性鼻炎、慢性炎症性肠病、肥胖、非酒精性脂肪肝、急性消化性溃疡等。体内研究方面,AOPPs能增加糖尿病大鼠肾脏组织单核细胞浸润及单核细胞趋化因子(Monocyte Chemotactic Protein-1,MCP-1)、转化生长因子(Transforming GrowthFactor-β,TGF-β)等促炎细胞因子的合成与释放,加速肾单位结构破坏,导致尿蛋白排出量增加,血肌酐升高；用AOPPs干预5/6肾切大鼠模型,也观察到了类似现象,同时还能使残肾的纤维化明显加快。AOPPs能促进正常新西兰白兔大动脉壁产生细胞炎症和脂滴沉积,加速高脂血症家兔动脉粥样斑块的形成。无论是糖尿病大鼠模型、5/6肾切模型还是正常新西兰白兔,AOPPs干预下相应组织中ROS均明显升高。体外研究方面,Witko-Sarsat等发现AOPPs能激活单核细胞,诱导呼吸链爆发,产生氧化应激。Guo等证实从慢性肾衰和糖尿病患者体内分离、纯化的AOPPs以及体外制备的AOPPs均可通过细胞表面的晚期糖基化产物受体((?)Receptor of Advanced Glycation End Products, RAGE)介导的、ROS敏感的MAPK和NF-κB信号通路激活人血管内皮细胞。AOPPs也能通过增加肾小球系膜细胞内超氧化物形成,使细胞合成TGF-β增加,并上调纤维蛋白和Ⅳ型胶原纤维基因、蛋白表达,导致系膜细胞外基质沉积。Zhou等用AOPPs干预3T3-L1脂肪细胞后发现TNF-α、IF-6的表达量明显上升,同时促发其产生胰岛素抵抗。AOPPs还具有以下生物活性：诱发成脂肪细胞内炎症反应并抑制其向脂肪细胞分化；介导肾脏足细胞损伤和凋亡；诱导心肌细胞死亡等。因此,AOPPs不仅是氧化应激的后果,其本身也是ROS来源,作为一种重要的炎症介质具有广泛的病理作用,可能参与人类多种重要疾病的发生、发展。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(Nicotinamide-Adenine Dinucleotide Phosphate,NADPH)氧化酶大量存在于中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和单核巨噬细胞中,其主要作用是在NADPH存在时将单电子传递给02形成ROS,在生成ROS的同时也伴随氧消耗量的骤然增加,所以这一过程称为呼吸爆发或氧爆发,是上述细胞生成ROS的主要机制。近年来的研究表明,NADPH氧化酶也是多种非单核巨噬细胞,包括成纤维细胞、血管平滑肌细胞、内皮细胞、肾小球系膜细胞和肾小管细胞ROS的重要来源。AOPPs可通过激活细胞内的NADPH氧化酶产生大量ROS,这也是AOPPs发挥众多生物活性的重要中间过程。Apocynin,译为夹竹桃麻素、加拿大麻素或香荚兰乙酮等,是胡黄连根茎的一种提取物,可特异性抑制NADPH氧化酶的活性。Lee等发现NADPH氧化酶阻断剂能明显抑制RANKL诱导的骨髓单核巨噬细胞内ROS产生而抑制破骨细胞分化。NADPH氧化酶抑制剂也能逆转AOPPs诱导的人血管内皮细胞炎症因子表达。同时,本课题组也证实Apocynin可阻断AOPPs对成骨样细胞的增殖和分化的抑制作用。体内研究也发现AOPPs能通过促进肾脏的氧化应激和炎症反应加速糖尿病大鼠肾脏损害,这一作用能被apocynin所阻断。因此,通过激(?)NADPH氧化酶生成大量ROS是AOPPs发挥众多生物活性的重要中间过程。研究表明：氧化应激是引发衰老的最重要原因之一,随着年龄的增加,体内氧化应激效应加强,氧化损伤不断积累。作为一类蛋白质氧化损伤产物,AOPPs浓度必然随着年龄的增加而升高,这在Komosinska-Vassev等的研究中也也得到印证。我们的前期研究不但发现不同年龄组大鼠血浆AOPPs浓度与其骨量呈反相关关系,也证实AOPPs能通过刺激ROS的生成而抑制成骨样细胞的增值与分化。作为一种老年性疾病,SOP患者体内升高的AOPPs是否在SOP的发生发展中发挥作用尚不清楚。本研究以18月龄雄性Sprague Dawley(SD)大鼠为增龄性骨质疏松模型,用外源性AOPPs进行干预,通过检测干预前后大鼠血浆AOPPs、骨密度、骨代谢指标、骨微结构参数以及生物力学参数的变化,旨在证明以下假说：AOPPs能通过增加老年大鼠体内氧化应激水平影响骨代谢过程,加速骨质退化。研究目的1.探讨外源性AOPP对老年雄性SD大鼠体内氧化应激水平的影响。2.探讨外源性AOPPs对老年雄性SD大鼠骨代谢的影响。3.探讨NADPH氧化酶抑制剂apcynin对AOPPs可能的促骨退化效应的阻断作用。研究方法1.体外制备AOPPs修饰的大鼠血清白蛋白溶液(AOPPs-RSA)。大鼠血清白蛋白(RSA)用PBS稀释成20mg/ml后与40mmol/L的NaC1O溶液等体积混合,在37℃环境下反应30分钟后立即在4℃环境下于PBS液中连续透析24小时,以除去游离的HC10。氯胺-T法测定制备的AOPPs-RSA中AOPPs浓度。用鲎试剂除去所配制的AOPPs-RSA溶液中的内毒素含量,使其浓度低于0.05ng/mg蛋白。于-20℃冰箱中保存备用。2.实验动物的药物干预及取材。购买18月龄雄性SD大鼠(成都达硕生物有限公司)70只,体重652±37g。饲养于适宜的环境中,给予充足的水和食物,严格昼夜周期。经10天环境适应期后随机分为A、B、C、D、E5组,分别给予以下处理：A组(PBS组),尾静脉注射磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline,PBS)1次/日；B组(RSA组),尾静脉注射RSA50mg/kg,1次/日；C组(AOPPs-RSA组),尾静脉注射AOPPs-RSA50mg/kg,1次/日；D组(AOPPs-RSA+apcynin组尾静脉注射AOPPs-RSA50mg/kg,1次/日,同时给予apocynin100mg/kg/日,经饮水摄入；E组(apcynin组),apocynin100mg/kg/日,经饮水摄入。每组14只,分别在药物干预8、16周后随机取每组中的7只经腹主动脉取血后处死,分离腰椎、双侧股骨及胫骨标本。动脉血取出后移入抗凝管,离心后分离出血浆分装,储存于-80℃冰箱中备用。骨标本分离后剥除表面软组织,生理盐水纱布包埋后储存于-20℃冰箱备用。3.指标检测(1)氯胺-T法测定各组大鼠血浆AOPPs浓度。血浆用PBS按1：5稀释,以氯胺-T同法稀释作空白对照,加入1.16mmoL/L的KI10uL及乙酸20uL后立刻用酶标仪在340nm波长下测出各孔的光吸收值。AOPPs浓度以氯胺-T浓度表示。(2)L4及左侧股骨的骨密度测量。按照文献介绍的方法,骨标本先在常温下解冻30分钟后,仔细去除周围软组织,再以生理盐水湿润。将准备好的标本在双能X线吸收仪上依次进行粗扫描和细扫描,运用“Small Object"程序计算出各标本的骨密度值。(3)骨代谢标志物测定骨特异性碱性磷酸酶(Bone-Specific Alkphase, BALP)以及抗酒石酸酸性磷酸酶5b (Tartrate-Resistant Acid Phosphatase5b, TRAP5b)分别是反应成骨细胞和破骨细胞活性特异性较高的骨代谢标志物,本实验采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组老年大鼠血浆中BALP以及TRAP5b的浓度差异,评价AOPPs对老年大鼠骨骨转换率的影响。(4)骨微结构分析。应用显微CT对第四腰椎(L4)及左侧胫骨行骨小梁微观结构分析(分辨率：12μm或15μm,电压：50kv,电流：0.1mA)。分析区域为：胫骨,胫骨平台最低点2mm下的180层骨松质区域；L4椎体,上下骨性终板之间四周骨皮质内的所用骨松质。分析得出各标本的以下参数：①骨小梁体积分数BV/TV(%)；②骨小梁厚度Tb.Th (mm);③单位体积骨小梁数目b.N(1/mm);④骨小梁分离度Tb.Sp(mm);⑤骨小梁结构异性程度(Degree of Anisotropy, DA);⑥结构模型指数(StructureModel Index, SMI)。同时对标本进行三维重建,获得骨小梁的空间结构图像。(5)生物力学测试骨标本在室温下完全解冻3小时后,测量股骨的长度以确定股骨干中点的位置。将标本放置于INSTRON E1000电子式动静态万能材料试验机一长20mm支架上,使股骨干中点与支架重点重合,在股骨干中点施加载荷,这样就形成了一个三点弯曲效应。载荷的速度为2mm/min,直至标本折断。通过形成的载荷-位移曲线,得出最大负荷(Maximum load,Max.L),刚度(Stifness,S)、最大位移(Maximum Displace,Max.D)以及能量吸收值(Energy)等指标。研究结果1.各组间的血浆总蛋白浓度两个时间点下都无明显差异。与PBS及RSA相比,AOPPs-RSA明显升高老年大鼠血浆AOPPs浓度(P<0.05),这一作用能被apcynin阻断。Apcynin对正常老年大鼠血浆AOPPs浓度无明显影响(P>0.05)。2.与PBS组及RSA组老年大鼠相比,AOPPs-RSA组L4椎体骨密度明显降低(P<0.05),这一作用能被apcynin阻断。各组间左侧股骨骨密度比较无明显差异(P>0.05)。Apcynin对正常老年大鼠骨密度无明显影响(P>0.05)。大鼠血浆AOPPs浓度与L4椎体骨密度相关(r=-0.772；n=70；P≤0.001)而与左侧股骨骨密度无明显相关(P>0.05)。3.与PBS及RSA相比,AOPPs明显降低血浆BALP浓度(P<0.05),而升高Tracp5b浓度(P>0.05),以上作用能被apcynin阻断。Apcynin对正常老年大鼠血浆BALP及Tracp5b浓度无明显影响。血AOPPs浓度与BALP浓度呈反相关(r=-0.841；n=70；P≤0.001)而与Tracp5b浓度呈正相关(r=0.832；n=70；P≤0.001)4.无论L4或左侧胫骨,与PBS及RSA相比,AOPPs在明显降低骨小梁BV/TV、Tb、Th同时升高Tb.Sp(P均<0.05),以上作用能被apcynin阻断。各组间Tb.N、DA、SMI匕较无明显差异(P>0.05)。Apcynin对正常老年大鼠骨小梁微观结构无明显影响(P>0.05)。大鼠血AOPPs浓度与L4及左侧胫骨的BV/TV、Tb.Th、Tb.Sp相关(L4：r分别为-0.720、-0.744、0.780,n=70,P均<0.05；左侧胫骨：r分别为-0.562、-0.559、-0.891,n=70,P均<0.05)。血AOPPs浓度与DA及SMI无明显相关性(P>0.05)5.三点弯曲实验中Max.L、S、Max.D、Energy各组间比较无明显差异(P均>0.05)。结论外源性AOPPs能显著影响老年大鼠骨代谢过程,加快其骨退化速度。