目的:研究银翘散制剂主要成分绿原酸抗流感作用及其相关细胞信号通路机制。方法:实验一银翘散制剂活性成分抗流感作用的研究1、银翘散制剂活性成分的体内抗流感作用初步筛选对小鼠流感病毒性肺炎作用的药物。将雌性Balb/c小鼠采用区间分组法,将所有小鼠称体重后,按照排列编上号,然后随机分组。设空白对照组、病毒模型组、利巴韦林组(100mg/kg)、绿原酸、紫苏醛、木犀草素、木犀草苷、薯蓣皂苷、薯蓣皂苷元、荭草苷、牡荆素组各10只,药量均为100mg/kg,0.5%吐温-80助溶。各组均用适量的乙醚轻度麻醉,分别用流感病毒FM1株5LD50滴鼻感染,每鼠4-6滴,约0.05毫升。攻击后2h开始给药。共给药6天,每日一次,按剂量灌胃给药,0.1mL/10g,病毒模型组给予等体积的0.9%氯化钠注射液作为对照。通过小鼠体内抗流感病毒药物药效测定方法,以感染病毒小鼠发病死亡为药效指标,观察上述中药材对感染甲1型流感病毒的小鼠死亡率、体重变化的影响,初步筛选上述中药材具有较好的抗流感病毒作用。2、基于细胞信号通路抗体芯片研究绿原酸抗流感作用机制在上述实验的基础上,选择其中有效的中药活性成分绿原酸,采用Full Moon公司的信号通路磷酸化抗体芯片和芯片配套试剂盒进一步研究其抗病毒疗效及其作用的信号通路靶标。按照Full Moon公司的标准操作流程进行操作。样品处理:A.样品蛋白抽提;B.样品蛋白标记;C.芯片检测操作。实验二基于细胞信号传导机制研究绿原酸抗流感作用及其机制对小鼠体内感染流感病毒的作用将120只雌性Balb/c小鼠采用区间分组法,将所有小鼠称体重后,按照排列编上号,然后随机分组。设正常对照组、病毒模型组、利巴韦林组(100mg/kg)、绿原酸高剂量(200mg/kg)、中剂量(100mg/kg)、低剂量(50mg/kg)组各20只。各组在乙醚轻度麻醉下分别以流感病毒FM1株5LD50滴鼻(i.n.,Intranasal)感染,每鼠5滴,约0.05毫升。攻击后2h开始给药。共给药5天,每日一次,按剂量灌胃给药,0.1mL/10g,正常对照组和病毒模型对照组给予等体积的0.9%氯化钠注射液作为对照。各组在感染病毒5天后从每组小鼠中随机抽取10只测量取全肺组织观察肺指数、观察小鼠肺部病变,并分别进行肺干湿重、肺病理、采用ELISA法检查肺组织炎症因子TNF-α,IL-1β,IL-4,IFN-γ,蛋白免疫印迹(western-blot)技术检测IKB α,NF-κ B P105流感病毒感染宿主细胞信号通路蛋白水平及抗病毒机制研究。其余10只继续观察感染后14天内动物的死亡情况,计算死亡率、死亡保护率、平均存活天数和生命延长率。结果:1.银翘散制剂活性成分抗流感病毒作用:研究表明绿原酸组的生存率高于其他小组的生存率,平均体重在第五第六天较其他药物组下降缓慢,与病毒组相比,差别有统计学意义(K0.05);绿原酸组的肺指数低于其他各组,与利巴韦林组相比,差别有统计学意义(P<0.05)。2.CSP100抗体芯片结果:芯片上重复点的平均信号值越大结果越可靠。Fold change>1.2 的有参考意义。结果表明,IKB-alpha、NF-κB p105、Src(Ab-529)和 PDK1(Ab-241)其对应的 Fold changes 分别为:5.19、5.10、1.49 和 1.42 均大于 1.2。选择Fold changes值较大的两者IKB-alpha、NF-κB p105进行验证。3.基于细胞信号通路绿原酸抗流感作用及其分子机制:结果表明,与病毒组相比,绿原酸高、低剂量组肺指数均有所降低,差别差别有统计学意义(P<0.05。绿原酸各剂量组均能降低流感病毒感染小鼠的死亡率,延长流感病毒感染小鼠的平均生存时间,与病毒组相比较,差别差别有统计学意义(P<0.05),表明绿原酸对流感病毒感染小鼠具有死亡保护作用。通过肺病理组织学检测,绿原酸各剂量组均较病毒组有改善流感病毒感染小鼠肺部炎症程度的作用。用Elisa方法测炎性细胞因子得出,绿原酸组高剂量组产生的IFN-高、IL-4含量增高,与病毒组相比,P<0.05,差别有统计学差异;绿原酸组高剂量组的IL-1高和TNF-高水平显著降低,与病毒组相比,P<0.05,差别有统计学差异,表明绿原酸能够抑制流感病毒小鼠病毒性肺炎的作用。最后,用Western blot检测细胞通路相关蛋白指标,与病毒组相比,绿原酸三个剂量组IKB α绿蛋白表达水平显著低于病毒组,与病毒组相比较,P<0.05,差别差别有统计学意义。结论:银翘散制剂主要成分绿原酸对流感病毒感染小鼠具有一定的治疗作用。绿原酸具有降低流感病毒感染鼠肺指数,提高生命延长率,明显改善肺炎病理,抑制肺组织炎症细胞因子水平。绿原酸可以抑制肺组织IKB α以和NF-κB P105的蛋白表达水平,发挥其抗流感病毒作用。本研究为利用绿原酸开发安全有效抗流感病毒的药物提供理论依据。