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苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis, 简称Bt)是应用最成功最广泛的微生物杀虫剂,但近年来抗性问题却严重影响了Bt的应用和发展。营养期杀虫蛋白(vegetative insecticidal protein, 简称VIPs)是一种全新的杀虫物质,与任何已知的杀虫晶体蛋白没有同源性,其杀虫机理也不同于已知的杀虫晶体蛋白。VIPs蛋白单独或是与Cry蛋白共同使用,或是组建融合基因构建工程菌,都将极大地扩大Bt的杀虫谱、提高毒力,同时还可以抑制害虫抗性的产生。
本文以本实验室提交到GenBank的vip3Aa18基因及其构建菌株为实验材料,运用生物信息学软件分析了Vip3Aa18蛋白的二硫键位点、结合域、蛋白酶水解位点等位点和功能区。预测结果显示,Vip3Aa18蛋白的第292位和401位的半胱氨酸能形成一个二硫键；C端(Aa539-Aa666)位置存在一个糖结合域；198和455位的蛋白酶水解位点可能与形成毒性核心片段有关。用定点突变技术构建了相应氨基酸位点的突变菌株：与二硫键有关的C401G、C507G、C401G&C507G突变菌株,与结合域有关的N555I、T570I、T570S、Y616A、Y629S、D660G突变菌株,与蛋白酶水解位点有关的K198D、K455N、K198D&K455N突变菌株(数字代表Vip3Aa18上突变的氨基酸位点,突变后位点前面的氨基酸变为后者)。将突变菌株进行诱导表达,并用甜菜夜蛾进行生物活性测定,与原始Vip3Aa18菌株的杀虫毒力进行比较,结果发现：
1.在Vip3Aal8内共有三个半胱氨酸(292位、401位、507位),软件预测292&401位能形成一个二硫键。生物活性测定显示C401G和C401G&C507G菌株对甜菜夜蛾几乎完全失去了杀虫活性,而C507G菌株的杀虫活性和原始Vip3Aal8菌株没有显著差异。生物活性测定结果与软件预测结果相符。所以,我们认为Vip3Aa18蛋白的292&401位能形成二硫键,并且二硫键在维持Vip3Aa18蛋白的高级结构及其毒性方面非常重要。
2.结合域内的T570I、T570S、Y629S、D660G突变菌株对甜菜夜蛾的杀虫活性也几乎完全丢失,而N555I和Y616A突变菌株的杀虫毒力与原始Vip3Aal8菌株基本相同,说明Vip3Aa18蛋白的570位、629位和660位氨基酸是结合域内的关键位点,在Vip3Aa18蛋白对甜菜夜蛾的杀虫作用中扮演了重要角色。
3.软件预测Vip3Aal8蛋白的198位和455位是潜在的蛋白酶水解位点,两个位点正常水解后能形成毒性核心片段,若不正常水解可能影响Vip3Aal8的杀虫活性,但生物活性测定结果显示K198D、K455N及K198D&K455N突变菌株对甜菜夜蛾的杀虫毒力与原始Vip3Aal8菌株相比均没有显著性差异,说明这两个水解位点的突变并不影响Vip3Aal8菌株的杀虫活性。在198位和455位附近还有其它水解位点,能影响杀虫活性的水解位点可能在它们附近。
本研究首次确定了二硫键的位置并证实了其对Vip3Aal8蛋白杀虫活性的重要性,发现了结合域内能影响Vip3Aal8杀虫活性的三个氨基酸位点,为揭示Vip3Aal8的结构和功能、阐明其杀虫机理提供了新的科学依据。