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哺乳动物卵母细胞向早期胚胎转换是不对称减数分裂转换为对称有丝分裂的重要生物学过程。AuroraA,作为一种高度保守的丝/苏氨酸蛋白激酶类细胞分裂调控因子,是否参与该转换进程的调控?其调节机制又如何?相关问题目前尚不明确。本研究结合Western blot与间接免疫荧光染色技术检测了 Aurora A在猪卵母细胞向胚胎转换进程中的动态表达与亚细胞定位,并通过Aurora A的特异性抑制剂MLN8054的抑制试验,分析了 AuroraA对猪卵母细胞减数分裂向胚胎有丝分裂转换进程的影响;在探讨Aurora A对猪胚胎首次有丝分裂过程的调控作用的基础上,检测了胚胎首次有丝分裂过程中MLN8054特异性抑制后Aurora A及其下游蛋白TACC3(transforming acidic coiled-coil 3)的表达,为了解该进程中Aurora A的相关分子调节机制提供依据。试验结果如下:1.猪卵母细胞向胚胎转换进程中AuroraA的动态表达与亚细胞定位Aurora A 及其 p-AuroraA(T288)在猪卵母细胞的 MⅠ期(metaphaseⅠ)、MⅡ期(metaphase Ⅱ)以及胚胎首次有丝分裂各个阶段均有表达。间接免疫荧光结合共聚焦成像技术发现,卵母细胞成熟分裂至MⅠ期与MⅡ期时,Aurora A对称分布在近皮质部染色体两侧;原核期时AuroraA散在分布于细胞质,无明显富集;有丝分裂前期细胞的AuroraA逐渐聚集浓缩成网状;随后,AuroraA对称分布在染色体两侧,随着姐妹染色单体分离而逐渐向两极移动,与α-tubulin的分布极为相似。根据上述结果推测,AuroraA与α-tubulin在猪卵母细胞向胚胎转换过程中可能具有相似的亚细胞定位。为验证该假设,本试验随后将Aurora A与α-tubulin进行免疫荧光共染,结果表明在卵母细胞向胚胎转换进程中,AuroraA的定位与α-tubulin的分布密切相关,尤其在纺锤体两极高度重合。提示AuroraA与纺锤体的动态分布与功能密切相关。2.抑制AuroraA对MⅠ期卵母细胞成熟与纺锤体、染色体结构的影响为进一步探讨AuroraA在猪卵母细胞向胚胎转换进程中的作用,本试验用Aurora A的特异性抑制剂MLN8054处理MⅠ期卵母细胞。结果表明,第一极体排出率呈浓度依赖性下降,成熟发育至MⅡ期的卵母细胞显著减少,亚细胞结构异常的卵母细胞比例显著增加,主要呈现纺锤体结构异常与染色体排列紊乱。但MLN8054处理,对于Aurora A抑制后能够发育至MⅡ的卵母细胞继续向胚胎期转换并无显著影响。结果表明,Aurora A主要通过调节纺锤体组装与染色体排列进而参与猪卵母细胞减数分裂进程的调控。3.Aurora A抑制对猪胚胎首次有丝分裂过程的调控作用及其机制研究为进一步研究Aurora A在猪卵母细胞激活后胚胎期首次有丝分裂过程中的作用,将激活后的猪胚胎经MLN8054处理后发现,卵裂率随着抑制剂浓度的增加而显著下降。猪胚胎首次有丝分裂进程紊乱,停滞于原核期的细胞显著增多,表明Aurora A可能与胚胎原核期向分裂期转换的调控密切相关。为系统研究Aurora A在该转换中的具体调节作用,收集经MLN8054处理的体外培养至12 h、18 h的早期胚胎,观察后发现MLN8054处理持续18 h时,胚胎显著阻滞在呈现a-tubulin未组装的原核期;MLN8054处理12h时,呈现一个原核(1pronuclear,1PN)的胚胎比例显著上升,而2PN比例显著下降;随后我们在体外培养的前12 h、以及12 h之后分别加入抑制剂后发现,12h之前MLN8054处理导致的原核形态变化对后期胚胎卵裂无显著影响,而12-18 h抑制Aurora A造成的α-tubulin组装与染色体凝集异常,显著影响猪原核期胚胎向前期的顺利转换。为进一步探讨Aurora A抑制导致该转换进程失败的调节机制,收集经MLN8054处理的体外培养至18 h的胚胎细胞,Western blot分析表明,经MLN8054处理后,p-Aurora A(T288)与p-TACC3(S558)的表达水平均显著下降,提示Aurora A可能主要通过调节下游TACC3的磷酸化水平参与猪原核期胚胎向分裂前期转换进程的调控。