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背景代谢相关脂肪肝病（metabolic associated fatty liver disease,MAFLD）,过去又称为非酒精性脂肪肝病（non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）,是全球重大的公共卫生事件之一。MAFLD以过度的甘油三酯（triacylglycerol,TG）等脂质累积及全身代谢障碍为特点,影响全世界25%的人口,严重威胁人们的生命健康。其发病机制仍未明确,也未有特效药物批准上市。因此,对MAFLD的发病机制进行深入地探索研究,寻找可能的干预靶点,对MAFLD的治疗具有重要意义。近年来,自噬尤其是脂质自噬被认为和脂质代谢降解密切相关。自噬是一种保守的分解代谢过程,在正常的生理过程中起着重要的作用。自噬可以降解错误折叠的蛋白质,清理功能不全的细胞器,并调节生长和衰老。MAFLD脂质累积的重要机制之一就是自噬能力的降低。自噬能力受多种因素影响,其中活性氧（reactive oxygen species,ROS）的过多生成造成的氧化应激（oxidative stress,OS）是影响自噬水平的重要因素之一。内质网（endoplasmic reticulum,ER）不仅是生物体内蛋白质的合成折叠场所,同时也是ROS产生的重要细胞器。当ER发生OS时,是否可以通过调节自噬进一步调控MAFLD仍未可知,其中的分子机制如何也尚不清楚。为了明确上述问题,我们分别采用高脂膳食（high fat diet,HFD）诱导的大鼠MAFLD模型和游离脂肪酸（free fatty acid,FFA）诱导的高脂细胞模型,从ER内ROS清除的角度研究ER内发生OS对自噬的调控及对MAFLD调控的作用及机制,为将来临床上防治MAFLD提供新的研究方向和思路。目的通过HFD诱导的大鼠MAFLD模型和FFA诱导的高脂细胞模型,研究ER发生OS对自噬的调控及MAFLD脂质累积的影响,并探讨其中具体的分子作用机制。方法1.SD大鼠通过HFD诱导建立MAFLD动物模型,随机分成Chow组与HFD组。Chow组用正常饲料喂养,HFD组用高脂饲料喂养,共3个月。2.大鼠肝组织TG累积水平通过TG检测试剂盒进行检测。3.大鼠肝组织抗氧化酶GPx8、GPx7、Prx4的m RNA水平通过Q-PCR方法进行检测。4.大鼠肝组织自噬分子LC3、p62、Atg5、Atg7蛋白水平;未折叠蛋白反应（unfolded protein response,UPR）相关分子PERK、eIF2α、ATF4、IRE1α、ATF6及对应的磷酸化蛋白水平;以及ER内抗氧化酶GPx8、GPx7、Prx4蛋白的水平等均通过Western Blot方法检测。5.人肝L-02细胞通过FFA诱导建立高脂细胞模型。通过感染病毒过表达GPx8、应用eIF2α的特异性去磷酸化抑制剂Salubrinal、感染病毒敲减Atg5等的方法干预ER内OS,ERS及自噬,研究ER内OS对脂质累积的调控及机制。6.细胞脂质累积水平通过油红O染色与BODIPY 493/503荧光染色进行检测。7.细胞TG累积水平通过TG检测试剂盒进行检测。8.细胞自噬流通过感染GFP-RFP-LC3腺病毒,荧光成像进行检测。9.细胞ER内H2O2水平通过感染ER-Hyper腺病毒和ER Tracker共定位,荧光成像进行检测。10.细胞脂质自噬水平通过感染GFP-LC3腺病毒和BODIPY 665/676共定位,荧光成像进行检测。11.细胞ERS的敏感性通过采用衣霉素干预,再用细胞活力试剂盒进行检测12.细胞抗氧化酶GPx8、GPx7、Prx4的m RNA水平;自噬分子Atg5的m RNA水平通过Q-PCR方法进行检测。13.细胞内自噬分子LC3、p62、Atg5、Atg7蛋白水平;UPR相关分子PERK、eIF2α、ATF4、IRE1α、ATF6及对应的磷酸化蛋白水平;以及ER内过氧化酶GPx8、GPx7、Prx4蛋白的水平等均通过Western Blot方法进行检测。结果1.HFD诱导大鼠肝脏脂质累积,肝组织ER内抗氧化酶表达显著降低,肝组织的UPR活性与自噬水平显著降低。肝组织TG检测表明HFD可以诱导大鼠肝组织TG水平显著提高,表明大鼠肝组织内脂质累积水平增加。Q-PCR与Western Blot结果均表明HFD可以抑制GPx8的表达,提示ER内发生OS。此外Western Blot结果表明LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平显著下降,p62的水平显著升高,提示大鼠肝组织自噬水平受到抑制。UPR相关蛋白PERK（Thr980）位点、eIF2α（Ser51）位点磷酸化水平与ATF4蛋白的水平显著降低,表明UPR活性受到抑制。2.FFA可以诱导人肝L-02细胞脂质累积,诱导细胞ER内发生OS,并且抑制了细胞的自噬与UPR活性。油红O染色、BODIPY荧光染色与细胞TG检测都表明FFA可以诱导L-02细胞脂质的累积。ER内H2O2水平检测表明FFA可以提高细胞ER内H2O2的累积水平,Q-PCR与Western Blot结果显示GPx8表达显著下降,表明FFA可以诱导L-02细胞ER发生OS。Western Blot结果表明FFA抑制细胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的水平,并提高p62的水平,提示FFA抑制细胞的自噬。UPR的PERK-eIF2α-ATF4通路的PERK（Thr980）位点、eIF2α（Ser51）位点磷酸化水平与ATF4蛋白的水平显著降低,细胞活力检测表明细胞对ERS的敏感性显著下降,细胞UPR活性受到抑制。3.抑制ER内OS提高了细胞UPR与自噬水平,缓解脂质累积。过表达ER内GPx8后,ER内H2O2检测表明ER内H2O2累积水平显著下降,ER内OS被抑制。LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平显著发生提高,p62水平也明显降低,提示自噬水平提高。PERK（Thr980）位点、eIF2α（Ser51）位点磷酸化水平与ATF4蛋白的水平也发生显著提高,细胞对ERS的敏感性得到改善,细胞UPR的活性升高。油红O染色、BODIPY荧光染色及TG水平检测均表明,过表达GPx8后,脂质累积情况明显好转。4.调控PERK-eIF2α-ATF4通路可调控自噬,改善脂质累积。过表达GPx8后再通过应用eIF2α去磷酸化抑制剂Salubrinal调控细胞UPR的PERK-eIF2α-ATF4通路。Western Blot结果表明Salubrinal可以抑制细胞ERS导致ATF4蛋白的水平下降,使其对ERS的敏感性显著下降,UPR的活性受到抑制。此外,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平显著降低,p62的水平显著升高,细胞的自噬流受到阻断,表明自噬水平受到抑制,脂质自噬水平也同样受到抑制,细胞内脂质累积水平增加。进一步提示ER内OS是通过调控PERK-eIF2α-ATF4通路进一步调控自噬水平,改善脂质累积。5.ER内OS通过调节自噬调控MAFLD。过表达GPx8后再敲减细胞自噬蛋白Atg5后,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的水平显著降低,p62的水平显著增加,自噬流受到阻断,细胞的自噬水平受到了抑制,脂质自噬的水平也受到了抑制。通过油红O染色、BODIPY荧光染色与TG水平检测,结果表明自噬抑制后细胞内脂质累积的水平增加,GPx8过表达带来的改善作用消失。提示ER内OS是通过调节自噬水平调控脂质的累积水平。结论1.高脂摄入可诱导内质网发生氧化应激,并诱导肝脏脂质累积形成MAFLD。2.内质网氧化应激可以通过调节PERK-eIF2α-ATF4通路调节自噬及脂质自噬调控MAFLD,改善内质网氧化应激可以通过提高UPR活性,提高自噬及脂质自噬,改善MAFLD。