造血干细胞移植(HSCT)是目前治疗血液恶性肿瘤的根治手段，但微小残留病(MRD)成为HSCT后肿瘤复发的根源。研究表明，CIK/NK细胞过继免疫治疗对于消除残留的肿瘤病灶、促进患者免疫系统的重建具有良好的效果，并逐步成为化学治疗和造血干细胞移植后清除残留肿瘤细胞的重要治疗手段。 骨髓间充质干细胞(BMMSC)是一类具有低免疫原性、体内外高增殖和多向分化潜能的原始细胞，可用于促进移植后的造血重建及组织修复等；其还具有独特的免疫学特性和免疫调节特性。BMMSC不表达或低表达主要组织相容性复合体(MHC)和共刺激分子，因此很难被宿主免疫系统识别，这使它们在输注到异基因宿主体内后，可能能够逃避宿主的免疫监视系统，在宿主体内长期存活，甚至在异种体内长期存活。 BMMSC联合HSCT可明显加速HSC植入，但近年发现BMMSC除了促进移植后造血重建和组织修复还具有独特的免疫学调节特性，在体外BMMSC可对淋巴细胞及NK细胞产生抑制作用。 目前我们课题组已有的研究显示BMMSC可造成异基因脐血来源CIK/NK细胞中CD69表达的下降，并增加CIK/NK细胞的凋亡率及其培养体系中CD4+CD25+调节T细胞的比例，但BMMSC对CIK/NK细胞体内的杀瘤活性的影响尚不清楚。目前临床上BMMSC的应用是和HSCT几乎同步进行的，而CIK/NK细胞的输注一般是在放疗、化疗或HSCT后间隔2～4周。虽然BMMSC和CIK/NK等免疫效应细胞使用时间并不重叠，但是如果体内长期存活的BMMSC可以抑制后期输入的CIK/NK细胞的抗肿瘤效应，削弱其过继细胞免疫治疗的疗效，将对恶性血液病患者的预后十分不利。如何制定达到最佳促进植入及GVL效应的B删SC及CIK/NK细胞共同移植策略仍需深入探讨。 本实验旨在利用NOD/SCID小鼠荷瘤模型证实分别使用不同的输注途径(如将BMMSC骨髓腔注射，CIK/NK细胞静脉输注)以及临床上目前已经开始应用的非同步输注(BMMSC和CIK/NK细胞的输注时间一前一后各自错开)能避免BMMSC对CIK/NK细胞的负性影响，达到既保留BMMSC对HSCT后的造血恢复促进作用和CIK/NK细胞的抗肿瘤活性，又不至于增加GVHD、造血延迟发病率以及移植后恶性血液病复发率的双重目的，这对BMMSC和CIK/NK细胞将来在恶性血液病患者的临床合理应用具有十分重要的意义。 材料和方法： 1.实验对象 5～6周龄，体重20～25g的NOD/SCID小鼠，雌雄不限：来自中山大学中山医学院动物实验中心(符合SPF标准)。 2.标本来源 骨髓(BM)：取自20～30岁健康志愿者。 脐血(CB)：来自本院健康足月妊娠产妇经产道分娩之胎儿脐静脉血。 K562细胞株：来自本实验室(脐血库)冻存的K562细胞株。 3.实验方法 3.1单个核细胞分离 采用Ficoll—Hapaque分离法。 3.2诱导扩增CIK/NK细胞 将收集到的脐血单个核细胞置于含有FLT—3、SCF、IL—2、IL—7、IL-15五种细胞因子的培养体系中诱导21d。其中： 1)细胞因子的终浓度：FLT—3、SCF、IL—7、IL-15为40ng/ml，IL—2为80ng/ml。 2)培养体系：采用含10％FBS的IMDM。 3.3实验分组 3.3.1不同途径和时段输入BMMSC对CIK/NK细胞在荷瘤小鼠体内抗瘤作用的影响 NOD/SCID小鼠共56只，分为A、B、C、D、E、F、G共7组(以下细胞数为每只鼠注射的数量)，每组8只，每只鼠经尾静脉接种K562细胞1×106(0.1ml)，接种K562细胞后12小时进行下列实验： A组：同时尾静脉输注人BMMSC(1×106/0.1ml)+CIK/NK细胞(1×107/0.1ml)。 B组：尾静脉输注人BMMSC(1×106/0.1ml)，48小时后CIK/NK细胞(1×107/0.1ml)尾静脉输注。 C组：同时小鼠胫骨骨髓腔输注入BMMSC(1×106/0.1ml)+CIK/NK细胞(1×107/0.1ml)尾静脉输注。 D组：小鼠胫骨骨髓腔输注人BMMSC(1×106/0.1ml)，48小时后CIK/NK细胞(1×107/0.1ml)尾静脉输注。 E组：CIK/NK细胞(1×107/0.1ml)尾静脉输注。 F组：48小时后CIK/NK细胞(1×107/0.1ml)尾静脉输注。 G组(单纯K562接种对照组)：除K562细胞外，不输注其它细胞。 计算各组NOD/SCID荷瘤小鼠的生存曲线；通过形态学、流式细胞术以及病理组织学方法检测其外周血、骨髓、肝、脾和肺等脏器的肿瘤细胞负荷情况。 3.3.2不同途径和时段输入两种细胞在体内的分布规律及相互作用机制探讨 按操作手册输注前每mlBMMSC悬液中加入5μ1 DiI染液(红色)，每mlCIK/NK细胞悬液中加入1μ1 CFSE染液(绿色)分别进行荧光标记。 每只NOD/SCID小鼠的BMMSC的输注量为1×106/只(0.1ml)，CIK/NK细胞为1×107/只(0.1ml)，共分4组，每组6只： A组：人BMMSC+人脐血来源CIK/NK细胞同时尾静脉输注。 B组：人BMMSC+人脐血来源CIK/NK细胞尾静脉输注，CIK/NK细胞输注在人BMMSC之后的48h。 C组：人BMMSC骨髓腔输注+人脐血来源CIK/NK细胞同时尾静脉输注。 D组：人BMMSC骨髓腔输注+人脐血来源CIK/NK细胞尾静脉输注，CIK/NK细胞输注在BMMSC之后48h。 CIK/NK细胞输注后24h、48h解剖NOD/SCID小鼠(每批次3只)，分别取小鼠肝、脾、肺、肾脏进行冰冻切片各3张，片厚约30μm，荧光显微镜下，观察计数每高倍镜视野红色和绿色荧光细胞的数量及其比例关系。 4.统计学处理 采用SPSS(16.0)软件包处理，行正态检验后，多组间行单因素方差分析(One—Way ANOVA Test)。显著性差异为P<0.05。 结论： 1.同部位(尾静脉)注射时BMMSC可明显抑制CIK/NK细胞杀伤肿瘤细胞的作用，而分开不同部位(骨髓腔和尾静脉)注射时BMMSC对CIK/NK细胞的抑制作用明显减弱。而BMMSC与CIK/NK细胞的输注时间是否间隔48h，BMMSC对CIK/NK细胞的抑制作用无明显差异。 2.BMMSC在体内可能会显著抑制与其相同路径输注的抗肿瘤杀伤细胞的抗肿瘤活性，而且就算BMMSC较CIK/NK细胞提前2天输注，这种抑制作用也还是存在。 3.相同部位、相同时段输注BMMSC与CIK/NK细胞时，两种细胞在体内有较大机会相遇且发生相互作用。 4.BMMSC在体内对CIK/NK细胞的抑制作用主要位于肺部和肝脏等内皮网状系统。 5.通过荷瘤动物模型的研究结果显示前期输入的BMMSC在体内会削弱CIK/NK细胞的GVL作用，提示在临床恶性血液病患者HSCT的同时或之后应用BMMSC，可能对MRD的清除不利，并可能会影响后继输入的CIK细胞、NK细胞或CTL等抗肿瘤免疫活性细胞的活性，从而增加肿瘤复发的风险。