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目的:砷是国际癌症研究机构确认的人类致癌物,因职业或非职业环境砷暴露致癌问题得到重视,但砷致癌的机制仍不清楚。肺是砷致癌的重要靶器官,流行病学调查已经发现砷暴露是肺癌发生的明确风险因素之一。上皮间充质转化（Epithelial mesenchymal transition,EMT）是与肿瘤发生发展密切相关的病理过程,其为肿瘤细胞摆脱其上皮特征和获得迁移特性提供了分子遗传基础。经此变化,细胞能够侵入原发肿瘤周围的组织,渗出到淋巴管或血管中,通过循环进入远处,最终定植于转移性生态位。E-cadherin与SNAIL是EMT过程重要的分子标志物。EMT过程中细胞因失去上皮特征而表现为E-cadherin降低及其抑制因子SNAIL升高。NFE2L1是调控机体氧化稳态,维持蛋白质平衡与代谢稳态的重要转录因子,其同家族成员NFE2L2激活在预防化学和放射（电离,紫外线）诱导的致癌作用中的保护作用已得到很好的证实,但NFE2L2也能够赋予恶性细胞放化疗抵抗,并通过介导获得性抗凋亡和代谢重编程等分子事件促进癌症的发展。NFE2L1与NFE2L2功能结构多有重叠,有可能成为砷性肺癌防治的重要新靶标。本研究利用长期环境相关剂量砷暴露的人支气管上皮细胞模型,从EMT的角度入手,结合NFE2L1的功能研究,探讨NFE2L1在砷致细胞恶性转化中的作用和可能机制,以期为防治砷性癌症提供新线索。研究方法:1.无机砷长期处理BEAS-2B人支气管上皮细胞:用0.1μmol/L、0.2μmol/L、0.5μmol/L的亚砷酸钠（NaAsO2,As）长期处理BEAS-2B细胞,包括NFE2L1长型基因沉默（NFE2L1-L-KD）细胞与对照（SCR）细胞,对照组为不予以As处理的同代数细胞。待细胞融合度至90%传代,隔天换液。于12周,24周,30周及36周收集细胞样品。2.无机砷处理BEAS-2B人支气管上皮细胞:用20μmol/L的As处理BEAS-2B细胞6 h,溶剂对照,收集细胞样品,Western blot检测NFE2L1-L蛋白表达水平。3.NFE2L1-L基因沉默与鉴定:用携带靶向NFE2L1-L shRNA的慢病毒（NFE2L1-L-KD）与非靶标阴性对照慢病毒（SCR）转染BEAS-2B细胞,用1μg/mL嘌呤霉素筛选稳定感染的细胞。用RT-qPCR检测NFE2L1-L的转录水平。20μmol/L As处理SCR细胞和NFE2L1-L-KD细胞6 h,Western blot检测NFE2L1-L蛋白表达水平。4.EMT检测:收取长期砷暴露的BEAS-2B细胞RNA和蛋白样品,分别利用实时荧光定量聚合酶链反应（Reverse Transcript Quantitative PCR,RT-qPCR）检测E-cadherin、SNAIL1、TWIST2 mRNA水平,以western blot检测E-cadherin、Vimentin蛋白表达情况,评价细胞EMT情况。5.恶性转化相关指标检测:在长期砷处理不同时点（12周,24周,30周和36周）,利用克隆形成实验检测细胞增殖能力变化,用细胞划痕愈合实验检测细胞迁移能力变化评价恶性转化程度。将长期砷暴露的SCR细胞和NFE2L1-L-KD细胞接种于35mm培养皿,24 h后倒置显微镜下拍摄细胞形态。6.NFE2L1-L基因过表达与鉴定:用携带靶向NFE2L1-L的慢病毒（NFE2L1-L-OE）与非靶标阴性对照慢病毒（SCR）转染人肾上皮细胞（293T）,用5μg/m L杀稻瘟菌素（Blasticidin）筛选稳定感染的细胞。并用RT-qPCR检测NFE2L1-L的转录水平。继用20 nmol/L促红细胞生成素（EPO）处理293T（NFE2L1-L-OE/SCR）细胞6 h,Western blot检测NFE2L1-L蛋白表达水平。7.NFE2L1-L基因影响SNAIL1表达水平:收取BEAS-2B细胞（NFE2L1-L-KD/SCR）与293T细胞（NFE2L1-L-OE/SCR）RNA,利用RT-qPCR检测NFE2L1-L以及SNAIL1mRNA水平。利用Western blot在蛋白水平检测E-cadherin表达水平。8.统计分析:本研究所有数据均使用GraphPad Prism5软件进行数据分析。结果:1.无机砷诱导人支气管上皮细胞（BEAS-2B）发生EMT和恶性转化:染毒36周后,0.1μmol/L、0.2μmol/L、0.5μmol/L的As处理组细胞的E-cadherin mRNA水平显著低于溶剂对照组（Veh）;SNAIL1与TWIST2 mRNA水平则比Veh组有明显的提高,差异有统计学意义（P<0.05）。在蛋白水平结果显示,0.1μmol/L和0.2μmol/L处理组,E-cadherin表达显著降低,Vimentin于0.2μmol/L和0.5μmol/L处理组显著升高。经0.1μmol/L的NaAsO2处理36周的BEAS-2B细胞在划痕48小时后,与对照组相比,划痕愈合效果明显。长期砷暴露各组的有意义克隆数目与对照组相比显著增加,差异有统计学意义（P<0.05）。2.无机砷诱导BEAS-2B细胞中NFE2L1表达:急性无机砷暴露诱导NFE2L1的表达水平明显增加,差异有统计学意义（P<0.05）。3.NFE2L1-L基因稳转沉默效果:NFE2L1-L-KD组NFE2L1-L的mRNA水平显著低于SCR组,差异有统计学意义（P<0.05）。无论Veh组还是As处理组细胞,NFE2L1-L-KD组的NFE2L1蛋白水平与SCR组相比显著降低。4.NFE2L1-L基因沉默抑制砷对BEAS-2B细胞的EMT诱导和恶性转化:于染砷24周,30周和36周发现NFE2L1-L-KD细胞与SCR细胞相比,EMT指标、划痕愈合能力和/或克隆形成能力有显著差异。砷暴露12周:各剂量砷处理组NFE2L1-L-KD细胞的E-cadherin的mRNA与蛋白表达水平均高于SCR细胞,而SNAIL1 mRNA水平分别降低至SCR细胞的0.5倍左右,差异有统计学意义（P<0.05）。显微镜下观察NFE2L1-L-KD细胞较于SCR细胞略有伸展,类似梭形改变。长期砷暴露24周使SCR细胞SNAIL1与TWIST2的mRNA水平显著高于Veh组。NFE2L1-L-KD细胞的SNAIL1与TWIST2的mRNA水平却显著低于同组的SCR细胞（P<0.05）;0.1μmol/L处理组SCR细胞E-cadherin表达显著降低,Vimentin蛋白水平也随着染砷剂量呈现正相关增长趋势。NFE2L1-L-KD细胞的E-cadherin表达显著高于同组SCR细胞。0.1μmol/L砷处理组的SCR细胞率先出现划痕愈合能力增强。砷暴露30周后SCR的SNAIL1与TWIST2的mRNA水平和E-cadherin蛋白表达趋势不变,而NFE2L1-L-KD细胞在0.5μmol/L处理组出现SNAIL1升高,E-cadherin下降的趋势（P<0.05）。0.1μmol/L砷处理组的SCR细胞形成有意义克隆数目显著高于Veh组,差异有统计学意义（P<0.05）。划痕愈合实验的结果所示,0.1μmol/L砷处理组的SCR细胞,其划痕愈合能力仍显著高于Veh组。砷暴露36周的SCR细胞SNAIL1与TWSIT2 mRNA升高,E-cadherin表达水平降低,NFE2L1-L-KD细胞仍只有在0.5μmol/L处理组有SNAIL1升高与E-cadherin降低的改变（P<0.05）。0.1μmol/L砷处理组的SCR细胞基本丢失铺路石形状,细胞边界粗糙,细胞间连接变差,形成有意义克隆数目显著高于Veh组,差异有统计学意义（P<0.05）。0.1μmol/L砷处理组的SCR细胞,其划痕愈合能力显著高于Veh组。5.NFE2L1-L基因对SNAIL1表达的影响:NFE2L1-L-KD细胞SNAIL1的mRNA水平显著降低,而E-cadherin蛋白表达水平显著提高,差异有统计学意义（P<0.05）。稳定转染NFE2L1-L过表达病毒的293T细胞（NFE2L1-L-OE）,其NFE2L1-L的mRNA水平比SCR细胞显著升高,差异有统计学意义（P<0.05）。EPO处理组（20nmol/L,6 h）NFE2L1-L-OE细胞的NFE2L1蛋白水平明显高于SCR细胞。随着NFE2L1基因过表达,SNAIL1出现mRNA水平升高结果,差异有统计学意义（P<0.05）。且NFE2L1-L过表达的细胞中E-cadherin的蛋白经20 nmol/L的EPO暴露6 h后表达水平显著低于SCR组。结论:1.长期环境相关剂量无机砷暴露诱导人支气管上皮细胞恶性转化和NFE2L1表达升高。2.NFE2L1沉默抑制无机砷所致人支气管上皮细胞EMT和恶性转化。3.NFE2L1可能通过正向调控SNAIL1表达参与无机砷暴露所致细胞EMT。