目的:矽肺是由于在生产过程中长期吸入游离性二氧化硅粉尘引起的一种以肺部纤维化为主的职业性疾病。在我国矽肺病例占尘肺总病例接近于50％，位居第一，是尘肺中危害最严重的一种疾病。虽然我国在控制游离性二氧化硅粉尘的产生和扩散、降低作业场所二氧化硅粉尘浓度、改善劳动环境方面做了大量工作，而且已取得了一定的成绩，但其危害的形势依然严峻，矽肺的预防和控制工作任重而道远。因此，进行矽肺发病机制的研究对矽肺的预防及治疗具有重要指导意义。　　 矽肺的基本病理改变是矽结节形成和肺间质弥漫性纤维化，其中矽结节是矽肺特征性的病理改变，按其纤维化程度可分为四级，即细胞性结节、纤维-细胞性结节、细胞-纤维性结节和纤维性结节，其纤维化程度随时间进展逐级增加。矽肺的发病机制目前尚不清楚，目前对矽肺发病机制的研究认为：矽肺是一种肺部的慢性炎症状态，可分为肺泡炎期和纤维化反应期。肺泡炎期肺内大量巨噬细胞被激活，释放大量的细胞因子，其中炎症因子可增加毛细血管的通透性，使大量中性粒细胞募集到肺组织内，同时巨噬细胞作为抗原递呈细胞(antigen presentingcells，APC)使大量初始T淋巴细胞活化为效应T淋巴细胞，向肺内炎症部位迁移，分泌Th1型细胞因子IL-2、IFN-γ等调控细胞免疫，其中IL-2通过自分泌和旁分泌效应促进更多T淋巴细胞分化、成熟和增殖；IFN-γ促进巨噬细胞和中性粒细胞的吞噬作用，表现为细胞性结节。纤维化反应期效应T淋巴细胞分泌Th2型细胞因子IL-4、IL-10等，促进巨噬细胞释放多肽生长因子，调控纤维母细胞的分化以及成纤维细胞的趋化作用、增殖及胶原的合成，同时抑制Th1型反应，细胞性结节逐渐向纤维性结节转化。矽肺的发生过程是Th1型细胞免疫应答到Th2型细胞免疫应答的一个有序的过程，是一个多细胞参与多因子调控的复杂的免疫过程。虽然Th1型细胞免疫应答的有效建立对肺内游离二氧化硅粉尘的清除具有重要意义，但过度进行却使肺组织的正常结构遭到破坏。　　 近年来，一类以表达IL-17为特征的新CD4+T细胞亚群Th17细胞引起了广泛的关注。大量研究证实，Th17细胞在人类自身免疫性疾病如实验性变应性脑脊髓膜炎、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、移植排斥，及严重的呼吸道过敏性炎症性疾病等的发生发展过程中发挥着重要的作用，特别是在炎症发展早期发挥的促炎性作用，提示炎症性疾病中T细胞免疫应答的建立并不仅仅是一个由Th1型到Th2型的有序过程，在T细胞免疫应答建立的早期可能存在着Th17型细胞免疫应答。在实验性矽肺的发生发展中，由Th17型免疫应答向Th1型免疫应答向Th2型细胞免疫应答的适时转化对于矽肺的发展及预后具有重要的影响，这一过程的启动或平衡出现紊乱都将导致疾病慢性化或正常肺组织的严重损伤，因此需要一种免疫调控机制对这一过程进行有效的调控。CD4+CD25+调节性T淋巴细胞(CD4+CD25+regulatory T cells，简称Tregs)是一类具有免疫调控功能的T淋巴细胞亚群，约占人和小鼠外周血CD4+T淋巴细胞的5％-10％。Tregs能够特异地表达转录因子Foxp3(叉状头/翅膀状螺旋转录因子)和表面分子CD25(IL-2Rα)、CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白-4)和GITR(糖皮质激素诱导肿瘤坏死因子受体)。其中，Foxp3对Tregs的发育具有关键作用，是其特征性标志。Tregs通过细胞-细胞直接接触和间接抑制两种方式发挥免疫学调控作用。其中，细胞-细胞直接接触是通过其表面膜分子CD25、CTIA-4、GITR等的粘附作用及分泌穿孔素或颗粒酶依赖机制直接抑制或杀伤效应细胞；间接抑制主要表现为分泌细胞因子IL-10、TGF-β对其它细胞进行免疫调控。其中IL-10主要通过抑制树突状细胞的MHCⅡ和共刺激因子的表达等机制抑制初始T细胞的活化，使获得性免疫反应受到抑制；通过抑制Th2型细胞因子的产生、IgE的合成、肥大细胞和嗜酸性粒细胞的生存与活化等机制来抑制Th2型反应。另外，无论是在炎症还是纤维化反应阶段过量表达IL-10都可以通过诱导IL-4和IL-13的表达发挥前纤维化活性。TGF-β是一个能调控细胞生长、分化、细胞外基质形成以及具有免疫抑制作用的蛋白家族。TGF-β可以抑制T细胞的活化，效应细胞的杀伤活性；在Th1型免疫反应中，TGF-β抑制INF-γ，TNF-α，IL-2的产生，对抗INF-γ，TNF-α的活性。　　 Tregs在矽肺的发生发展过程中怎样调控Th1/Th2应答和Th1/Th2极化的?影响Th1与Th2应答的时效特征如何?机制如何?是否是通过抑制初始T细胞的活化或效应T淋巴细胞的活性调控免疫应答?是否通过调控Th1/Th2极化而影响矽肺的病理进程?Tregs对矽结节形成的影响如何?作用机制如何?　　 为回答上述问题，我们拟利用鼠矽肺模型，特别是采用Tregs体内阻断实验，直接观察Tregs在矽肺发生发展过程中的作用地位，通过对比分析不同模型免疫应答的变化特点，以期确立Tregs在矽肺Th应答建立和Th1/Th2极化调控过程中相关的效应机制，旨在为矽肺的预防和有效控制提供新的理论依据。　　 实验方法:　　 1、建立不同Tregs的C57BL/6小鼠矽肺模型C57BL/6小鼠(6-8w龄，雌性)经腹腔注射100μg anti-CD25 mAb，消除小鼠体内Tregs，建立抗体消除模型。单纯矽肺模型组、对照组C57BL/6小鼠腹腔注射等体积的IgG1抗体。抗体消除组、单纯矽肺模型组、对照组C57BL/6小鼠分别行暴露式气管内注入法灌注二氧化硅颗粒悬液和生理盐水。将不同Tregs的C57BL/6小鼠矽肺模型各组动物分别于7，28，56天处死，收集BALF；收集肺门淋巴结、脾组织，用于制备细胞悬液。摘取肺脏，部分-80℃保存；部分固定，用于病理实验。　　 2、Tregs对矽肺炎性特征影响的观察将不同时间各组动物收集的BALF500r/min，4℃，离心10min，收集细胞悬液，取20ul细胞悬液至于细胞计数板上，进行细胞计数。细胞数=(四个大格的细胞总数/4)×104。取400ul肺泡灌洗液，室温1500rpm离心8min，弃上清，加入200ul FCS混匀，推片，室温晾干，用甲醇固定，37℃温箱过夜，用Giemsa染液染色，室温15min；蒸馏水背冲，晾干。油镜下计数200个细胞中巨噬细胞，中性粒细胞，淋巴细胞的数量。　　 3、Tregs对矽结节病理过程影响的动态观察肺组织常规石蜡切片(5μm)，进行HE染色，石蜡切片放入烘箱内烘烤2小时；然后将肺组织切片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟；梯度酒精浸泡各1分钟，脱去二甲苯；流水冲洗5分钟；苏木精染色液浸染10分钟，自来水冲洗，返蓝；2％盐酸酒精20秒至1分钟；自来水冲洗12到24小时；0.5％伊红染液浸染1至2分钟，流水冲洗；梯度酒精脱水；二甲苯透明，中性树胶封片。小鼠实验性矽肺采用四级分类法：未发生病变用“0”表示，Ⅰ级为细胞性结节；Ⅱ级为纤维细胞性结节；Ⅲ级为细胞纤维性结节；Ⅳ级为纤维性结节。　　 4、不同小鼠模型中Tregs数量的观察取0.1ml脾、肺门淋巴结、肺泡灌洗液细胞悬液(106细胞)，应用anti-CD3-Percp，anti-CD4-PE-CY7，anti-CD25-APC，4℃条件下避光孵育30min，3％FBS的PBS清洗细胞两次，破膜液孵育细胞30min，再次清洗细胞两次，应用anti-FOXP3-FITC，anti-CTLA4-PE孵育细胞1hour，进行胞内染色。清洗后，加入1％多聚甲醛的PBS300ul，混匀，流式细胞仪检测。FACSCantoⅡ流式细胞仪Diva软件进行分析。以FSC、SSC、anti-CD3-percp、anti-CD4-PE-cy7定义CD4+T细胞，计算这一细胞群内CD3+CD4+CD25+Foxp3+细胞的比例所占的比例。　　 5、Tregs对Th应答建立时效特征和效应差异的影响取100mg肺组织，加入1ml Trizol试剂，冰浴匀浆，12000rpm离心10分钟，将上清转移至新管中，室温静置5分钟；每管加入200μl氯仿，用力震荡15秒，室温静置2-3分钟；4℃，12000rpm，离心15分钟；从每管中吸取上清至另一新的1.5ml EP管。加入等体积-20℃预冷的0.5ml异丙醇，混匀后室温沉淀10分钟；4℃，12000rpm离心10分钟后，弃上清；加入4℃预冷的75％乙醇，洗涤沉淀及离心管壁；4℃，7500rpm离心5分钟，弃上清；室温干燥5-10分钟；加入30μlRNase-free水，至完全溶解，测定RNA浓度并调整至11μg/μl。参照Invitrogen公司的逆转录酶操作说明书，将RNA逆转录成cDNA，即在PCR反应管中加入逆转录反应液，每管加入2μgRNA样品和逆转录反应液。按下列条件进行逆转录反应：37℃15分钟，85℃5秒钟。设定程序为两步法real time定量，预变性90℃30秒，之后每一步变性95℃5秒，退火延伸60℃34秒，共进行40个循环；相对定量法计算各组小鼠目标基因IL-2、IL-4及IL-17mRNA相对表达量。　　 6、Tregs对实验性矽肺Th免疫应答调控机制的研究取0.1ml脾、肺门淋巴结(106细胞)，应用anti-CD3-Percp，anti-CD4-PE-CY7，anti-CD25-APC，4℃条件下避光孵育30min，3％FBS的PBS清洗细胞两次，破膜液孵育细胞30min，再次清洗细胞两次，应用anti-FOXP3-FITC，anti-CTLA4-PE孵育细胞1hour，进行胞内染色。清洗后，加入1％多聚甲醛的PBS300ul，混匀，流式细胞仪检测。FACSCantoⅡ流式细胞仪Diva软件进行分析。以FSC、SSC、anti-CD3-percp、anti-CD4-PE-cy7定义CD4+T细胞，计算这一细胞群内CD3+CD4+CD25+Foxp3+CTLA4+细胞数量。取100mg肺组织，加入1ml Trizol试剂，冰浴匀浆，12000rpm离心10分钟，将上清转移至新管中，室温静置5分钟；每管加入200μl氯仿，用力震荡15秒，室温静置2-3分钟；4℃，12000rpm，离心15分钟；从每管中吸取上清至另一新的1.5ml EP管。加入等体积-20℃预冷的0.5ml异丙醇，混匀后室温沉淀10分钟；4℃，12000rpm离心10分钟后，弃上清；加入4℃预冷的75％7，醇，洗涤沉淀及离心管壁；4℃，7500rpm离心5分钟，弃上清；室温干燥5-10分钟；加入30μl RNase-free水，至完全溶解，测定RNA浓度并调整至1μ/μl。参照Invitrogen公司的逆转录酶操作说明书，将RNA逆转录成cDNA，即在PCR反应管中加入逆转录反应液，每管加入2μgRNA样品和逆转录反应液。按下列条件进行逆转录反应：37℃15分钟，85℃5秒钟。设定程序为两步法real time定量，预变性90℃30秒，之后每一步变性95℃5秒，退火延伸60℃34秒，共进行40个循环；相对定量法计算各组小鼠目标基因IL-10、TGF-βmRNA相对表达量。　　 7、统计学分析全部数据采用SPSS13.0统计学软件进行分析，统计结果表示为mean士S.E.M，采用单因素方差分析比较各组间的统计学差异；当差异有统计学意义时，用SNK法进行组间比较，p<0.05具有统计学意义。　　 实验结果:　　 1、腹腔注射CD25抗体有效的消除了小鼠体内CD4+CD25+调节性T细胞抗体消除组小鼠腹腔注射抗CD25单克隆抗体，对照组及模型组小鼠腹腔注射抗IgG1抗体，经流式细胞技术检测，染尘后7天、28天、56天抗体消除组小鼠脾组织中CD4+CD25+调节性T细胞占CD4+细胞比例较模型组、对照组显著降低，差别具有统计学意义。腹腔注射CD25抗体有效的消除了小鼠体内CD4+CD25+调节性T细胞。　　 2、不同组别小鼠肺泡灌洗液炎性细胞分类计数结果染尘后7天，抗体消除组小鼠肺泡灌洗液细胞总数、中性粒细胞数较模型组升高，两者均高于对照组，抗体消除组小鼠肺泡灌洗液淋巴细胞数、巨噬细胞数与模型组无明显差异，两者均高于对照组，差别有统计学意义。染尘后28天，模型组小鼠淋巴细胞数、巨噬细胞数量高于抗体消除组，两者均高于对照组。模型组与抗体消除组中性粒细胞无明显差异，两者均高于对照组。染尘后56天，模型组淋巴细胞数高于抗体消除组，两者均高于对照组。抗体消除组细胞总数、中性粒细胞、巨噬细胞数和模型组无明显差异，两者均高于对照组。　　 3、Tregs对矽结节病理过程影响的动态观察矽肺组7天肺组织病理观察炎性细胞广泛浸润，肺泡间隔增厚，可见不规则的细胞性结节。28天矽肺组肺组织炎症明显减轻，细胞性结节较7天变大，数量增多，可见纤维细胞性结节。56天矽肺组肺组织炎症基本消退，纤维细胞性结节增多，可见细胞纤维性结节。抗体消除组小鼠7天炎性细胞浸润明显较矽肺组重，肺间隔明显增厚，可见较多不规则的细胞性结节。28天抗体消除组炎症减轻，细胞性结节较7天略有增大，数量无明显增多，结节中细胞略有减少。56天抗体消除组肺组织炎症明显减轻，可见不规则的细胞性结节和纤维细胞性结节。生理盐水组小鼠肺组织结构基本正常，未见明显病理改变。　　 4、小鼠染尘后不同组织中Tregs数量的变化染尘后7天，模型组小鼠脾、肺门淋巴结、肺泡灌洗液中Tregs/CD4+比例高于对照组，两者均高于抗体消除组。染尘后28天，模型组小鼠脾、肺门淋巴结Tregs/CD4+细胞的比例与对照组无明显差异，两者均高于抗体消除组，肺泡灌洗液中Tregs/CD4+比例高于对照组，两者均高于抗体消除组。染尘后56天，模型组小鼠脾Tregs/CD4+细胞的比例略高于对照组，差别没有统计学意义，两者均高于抗体消除组；模型组与抗体消除组肺门淋巴结中Tregs/CD4+细胞的比例较对照组降低；模型组小鼠肺泡灌洗液中Tregs/CD4+比例高于对照组，两者均高于抗体消除组。模型组小鼠脾、肺门淋巴结中Tregs/CD4+细胞的比例随时间成下降趋势。　　 5、Tregs对Th应答建立时效特征和效应差异的影响染尘后7天，模型组及抗体消除组小鼠肺组织中IL-2mRNA的含量较对照组升高。染尘后28天及染尘后56天，模型组小鼠肺组织中IL-2mRNA的含量与对照组无明显差异，两者均低于抗体消除组IL-2mRNA的含量差别有统计学意义。模型组小鼠IL-2mRNA的含量成降低趋势；染尘后7天，模型组及抗体消除组小鼠肺组织中IL-4mRNA的含量与对照组无明显差异。染尘后28天，模型组小鼠肺组织中IL-4mRNA的含量较抗体消除组及对照组升高，但差别无统计学意义。染尘后56天，模型组小鼠肺组织中IL-4mRNA的含量，较抗体消除组高，两者均高于对照组。模型组、抗体消除组小鼠IL-4mRNA的含量随时间升高，模型组小鼠升高较抗体消除组更为显著；染尘后7天，模型组较抗体消除组小鼠肺组织中IL-17mRNA的含量升高，两者均高于对照组。染尘后28天，模型组小鼠肺组织中IL-17mRNA的含量较抗体消除组及对照组升高。染尘后56天，模型组小鼠肺组织中IL-17mRNA的含量，较抗体消除组)高，两者均高于对照组。模型组、抗体消除组小鼠IL-17mRNA的含量随时间降低。　　 6、Tregs对实验性矽肺Th免疫应答调控机制的研究染尘后7天，模型组小鼠脾、肺门淋巴结CTLA4细胞的数量较对照组升高，两者均高于抗体消除组，差别具有统计学意义。染尘后28天，模型组小鼠脾CTLA4细胞的数量较对照组升高，两者均高于抗体消除组；模型组小鼠淋巴结CTLA4细胞数量与对照组无明显差异，两者均高于抗体消除组。染尘后56天，模型组小鼠脾组织中CTLA4细胞的数量与对照组无明显差异，两者均高于抗体消除组；模型组小鼠淋巴结CTLA4细胞数量与抗体消除组无明显差异，均低于对照组。模型组小鼠脾、肺门淋巴结中CTLA数量随时间降低。抗体消除组和对照组脾、肺门淋巴结中CTLA数量随时间无明显变化；模型组小鼠肺组织中IL-10mRNA的含量较抗体消除组与对照组显著升高。模型组小鼠肺组织IL-10mRNA的表达量随时间升高，染尘后56天与染尘后7天差别有统计学意义；染尘后7天，模型组小鼠肺组织中TGF-βmRNA的含量略高于抗体消除组与对照组，差别没有统计学意义。染尘后28天，模型组与抗体消除组小鼠肺组织中TGF-βmRNA的含量较对照组高，差别有统计学意义。染尘后56天，模型组小鼠肺组织中TGF-βmRNA的含量，较抗体消除组及对照组升高。模型组小鼠TGF-βmRNA的含量随时间升高，染尘后56天与染尘后7天差别有统计学意义。　　 结论:　　 1、在实验性矽肺中，Tregs的消除导致炎症反应加重，延缓了实验性矽肺的病理进程。　　 2、在实验性矽肺发生发展过程中，Tregs数量逐渐降低。Tregs的消除延缓了实验性矽肺Th1型反应向Th2型反应的极化。　　 3、在实验性矽肺中，Tregs可通过CTLA-4分子和细胞因子IL-10及TGF-β发挥其免疫抑制作用。