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长牡蛎是世界范围内重要的海水养殖品种,也是软体动物门,冠轮动物超门最具代表性的物种之一。然而近年来长牡蛎大规模死亡事件频发,特别是夏季苗种繁育时期稚贝的大量死亡,逐渐成为制约养殖业健康持续发展的一个限制性因素。本论文主要采用分子免疫学等技术,分析了长牡蛎幼虫在早期个体发育过程中的免疫防御能力,探讨了造血相关转录因子在个体发育过程中的表达模式,并据此对长牡蛎发育过程中的造血作用进行了初步分析。研究结果进一步深化了无脊椎动物免疫系统发生和发育的研究,同时对贝类病害防控具有重要的指导意义。一、长牡蛎早期发育过程中免疫能力的检测在早期D形幼虫(17 hpf)中观察到吞噬现象发生于面盘区域。此外,模式识别分子(integrinβ-1、caspase-3和C-type lectin 3)和免疫效应分子(IL17-5)的蛋白定位在面盘和消化腺区域,推测它们为免疫系统发生的潜在位点。孵化期(9 hpf)为胚胎期和浮游期之间的过渡阶段。抗氧化酶(EC-SOD和CAT)和溶菌酶的活性,以及12个候选免疫因子的m RNA表达水平在孵化期处于发育过程中的最低水平。随后在担轮幼虫期(15 hpf),3种酶的活性和7个候选免疫因子的m RNA表达量均开始上升。个体发育至D形幼虫期(50 hpf),6个候选免疫因子的m RNA表达水平出现上升趋势,壳顶幼虫期(120 hpf),12个候选免疫因子的m RNA表达水平均出现稳定的上升趋势。灿烂弧菌刺激后,D形幼虫中12个候选免疫因子的m RNA表达水平均显著上调。上述结果表明幼虫在孵化期时免疫能力相对较低,当发育至担轮和D形幼虫期,免疫系统开始发生发育,在病原菌的刺激下,免疫系统能够被进一步激活。壳顶时期的幼虫已经具备较为完善的免疫系统,能够对外界刺激产生有效的免疫应答。二、长牡蛎Cg-SCL基因的鉴定与功能分析克隆获得长牡蛎造血相关转录因子Cg-SCL基因的c DNA序列,发现其含有一个保守的b HLH结构域,并与脊椎动物及海胆中的同源SCL基因具有较高的相似性。Cg-SCL在牡蛎成体血细胞、鳃和外套膜组织中有较高的m RNA和蛋白表达水平。在长牡蛎早期个体发育过程中,Cg-SCL的m RNA表达水平从受精后缓慢上升,担轮幼虫早期(10 hpf)达到峰值,然后下降,直至个体发育至壳顶幼虫期(120 hpf)。整体免疫荧光定位显示Cg-SCL最先出现在囊胚期(4 hpf),呈现为近似对称性的两点,并且这一表达模式持续到原肠胚期(8 hpf),至担轮幼虫期Cg-SCL分布于背部区域并呈现为清晰的环形结构,D形幼虫期,Cg-SCL蛋白在背部区域特化为两个窦穴状结构,同时以纤维状贯穿整个幼虫体内。灿烂弧菌刺激后,D形幼虫和壳顶幼虫中Cg-SCL m RNA表达水平均出现显著上调。在成体长牡蛎中,Cg-SCL的干扰会引起血细胞特异性基因(Integrin和Ec SOD)和造血相关转录因子(GATA3,C-Myb和c-kit)的显著下调。上述结果说明Cg-SCL可以作为长牡蛎造血作用的标记分子,从其表达模式推测长牡蛎中造血作用类似于果蝇,存在胚胎和幼虫两次造血过程。胚胎造血发生于囊胚时期,幼虫造血则发生于担轮幼虫时期,Cg-SCL可能在两次造血过程中均发挥重要的作用,可以作为长牡蛎造血作用的潜在标记分子。三、长牡蛎Cg-Runt基因的鉴定及其时空表达模式克隆获得长牡蛎造血相关转录因子Cg-Runt基因的c DNA序列,生物信息学分析发现它含有一个保守的Runt结构域,同源于Runx家族分子中的Runx1基因。在血细胞、鳃和外套膜组织中检测到较高的Cg-Runt m RNA和蛋白表达水平。在长牡蛎早期个体发育过程中,Cg-Runt在受精卵和胚胎期均有表达,且在担轮幼虫早期(10 hpf)达到表达峰值,但进入D形幼虫期后,Cg-Runt m RNA表达水平显著降低。整体免疫荧光定位显示Cg-Runt蛋白在囊胚期(4 hpf)不规律地分布于整个胚胎,原肠胚期(8 hpf)分布于植物极,在担轮幼虫期(15 hpf)则分布于背部区域并呈现清晰的环形结构,在D形幼虫早期(22 hpf),Cg-Runt蛋白在消化腺区域特化为窦穴状结构,D形幼虫期(50 hpf)以后蛋白信号呈纤维状贯穿整个幼虫体内,并且在壳顶幼虫(120 hpf)期,信号更加强烈。研究结果表明Cg-Runt参与幼虫造血过程,此外还可能在个体发育早期和幼虫后期参与细胞分化和组织形成。四、长牡蛎Cg-GATA-2/3基因的鉴定与功能分析克隆获得长牡蛎造血相关转录因子Cg-GATA-2/3基因的c DNA序列,生物信息学分析发现它含有两个串联重复的Zn F_GATA锌指结构域,与脊椎动物中的GATA-2和GATA-3,以及海洋动物中的同源GATA基因聚为一个大的类群。在血细胞、鳃和外套膜组织中检测到较高Cg-GATA-2/3的m RNA和蛋白表达水平。整体免疫荧光定位显示Cg-GATA-2/3蛋白在囊胚(4 hpf)和原肠胚期(8 hpf)不规律地分布于整个胚胎。随着胚胎不断发育在担轮幼虫期(15 hpf)迁移至背部区域并呈现为清晰的环形结构,在D形幼虫早期(22 hpf)在背部区域特化为两个窦穴状结构,并持续到D形幼虫中期。随着个体发育为壳顶幼虫(120 hpf),Cg-GATA-2/3蛋白的表达增多,集中分布于背部区域及面盘处。在成体长牡蛎中,Cg-GATA-2/3的干扰引起血细胞特异性基因Ec SOD和造血相关转录因子C-Myb的显著下调,同时导致循环血细胞和鳃组织中的新生细胞数目显著减少。以上研究结果表明Cg-GATA-2/3参与了胚胎和幼虫两次造血,对长牡蛎血细胞的生成具有重要的调控作用,可能主要通过调控Cg-SCL而间接参与胚胎造血,并协同Cg-SCL、Cg-Runt共同调控幼虫造血。综上所述,在长牡蛎的早期个体发育过程中,母源免疫物质在胚胎早期为个体提供重要的免疫保护作用。个体免疫系统在担轮幼虫期开始发生发育,胚胎造血和幼虫造血相继发生在囊胚期和担轮幼虫期,其中转录因子Cg-SCL和Cg-GATA-2/3可能参与胚胎造血,Cg-SCL、Cg-Runt和Cg-GATA-2/3共同参与幼虫造血作用;随着幼虫的发育,D形幼虫的血细胞开始具有吞噬能力,免疫系统在壳顶幼虫时期基本发育完善。