乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,全世界每年约有130万妇女患乳腺癌,50万人死于乳腺癌,其发病率逐年上升,目前国内约有47万患者,成为妇女健康的最大威胁,在一些城市乳腺癌已成为妇女恶性肿瘤发病的首位。乳腺癌的治疗包括手术治疗、内分泌治疗、放射治疗、化学治疗和分子靶向治疗等方法。近年来虽然放疗及化疗在设备和技术上取得了很大的进步,但乳腺癌的5年生存率仍然不高。此外,放疗和化疗造成的局部及全身副作用导致病人的身心都承受极大的伤害,未能从根本上改善治疗效果。因此,探索乳腺癌的病因及新的安全有效的治疗方法成为乳腺癌治疗的瓶颈。恶性肿瘤的发生和侵袭转移过程受多层次、多因素调控,癌基因与抑癌基因作用的失衡是其中的关键环节之一。因此,寻找新的或进一步揭示已有癌基因或抑癌基因的功能,对阐明恶性肿瘤发生和演进机理、研发潜在治疗靶点具有重要意义。端粒,位于真核细胞染色体末端,是一种特殊的由富含G碱基的重复DNA序列与相关蛋白质组成的复合体,保护末端染色体不被降解和防止染色体末端融合,对维持细胞基因组的稳定性有重要作用。在大多数细胞中,端粒长度主要由一种特殊的RNA逆转录酶—端粒酶以及端粒相关蛋白调节,端粒相关蛋白通过直接或间接与端粒DNA相互作用来维持端粒结构和功能的稳定。由于存在末端复制问题,即随着细胞分裂,DNA每复制一次,都伴随有末端端粒的部分丢失。如此,端粒将发生进行性缩短,当端粒缩短到一定程度时,失去端粒保护的染色体将变得不稳定,致使细胞进入不安全状态,出现凋亡、死亡等改变。端粒酶可以不断补充DNA复制所造成的端粒丢失,因而端粒的长度并不会随着复制而发生进行性缩短,从而维系细胞稳定。端粒功能的缺失很可能导致细胞基因组的不稳定,使细胞进入不正常状态,正常细胞转化为癌细胞的风险也随之大大增加。近几年来,还有越来越多研究表明传统的端粒蛋白不仅仅定位在端粒末端,保护正常的端粒结构,有些还直接参与细胞有丝分裂进程的复杂调控,例如端粒相关蛋白TERF1(Telomeric repeat-binding factor1), TERF1的蛋白表达量在整个细胞周期中呈现动态变化,此外,TERF1能够和微管,微管相关蛋白EB1以及一些重要的纺锤体检验点蛋白比如Madl, NekZ以及Plkl等相互作用。包括乳腺癌在内的绝大多数恶性肿瘤与端粒酶活性及其亚单位hTERT(human telomerase reverse transcriptase)活性增高有密切关系。随着对端粒酶研究的深入,以端粒酶为靶点,进行肿瘤靶向基因治疗成为有前景的治疗方法之一,因而,探寻端粒酶抑制剂成为新的热点研究之一。PinX1为2001年报导,应用酵母双杂交方法,以细胞周期蛋白Pin2为诱饵,在人类宫颈癌细胞中发现的一个能与端粒/端粒酶相互作用的保守核仁蛋白。人PinX1(PinX1, humanPinX1)基因定位于染色体的8p23,是一处在多种肿瘤中发生高频杂合缺失的区域。PinX1蛋白全长328aa,N-端(aa1-142)和C-端(aa254-328)各含一个hTERT结合位点。PinX1是迄今为止发现的最强力的端粒酶抑制因子,PinX1的端粒酶抑制作用通过其本身与hTERT和hTR直接作用来实现,尽管如此,Pinx1在酵母中的同源物Gno1p中是否具有端粒酶抑制作用目前还存在争议。高表达PinX1C-端片断对细胞端粒酶活性有显著抑制作用,缩短端粒长度并抑制端粒酶阳性癌细胞生长。因此,PinX1被认为是细胞内在的端粒酶抑制因子和潜在的抑癌基因,但PinX1对细胞端粒酶/端粒的具体调控机制及在肿瘤中的意义仍不清楚。此外,PinX1还被证明可以与端粒蛋白TERF1相互作用,有研究表明,PinX1在端粒阳性肿瘤中可以增强TERF1在核仁的定位,但其具体作用发生机制还未被具体阐明。虽然PinX1被认为是强的端粒酶抑制因子和潜在的抑癌基因,但是PinX1在肿瘤中的发挥的具体作用和作用机制仍存在争论。国内外都有研究表明,PinX1在胃癌和肝癌中表达量明显下降,但在前列腺癌中却未发现有下降的异常表达。同是在肝癌组织中,有学者发现PinX1可以发挥调节端粒酶长度的作用,但对癌的形成并无影响。甚至有研究表明,在急性白血病中,端粒酶的长度与PinX1表达量呈正相关的关系。PinX1可能在不同的肿瘤中参与的作用机制不同,所以发挥的作用也各有差异。关于PinX1与乳腺癌发生发展的关系,大多数学者倾向于认为PinX1在乳腺癌中具有抑癌作用,但该结论仍未得到一致认同,存在较大的争论。本文主要研究该基因在乳腺癌中的表达情况,分析其对乳腺癌细胞MCF-7增殖情况和细胞周期的影响,观察PinX1蛋白在不同周期中的定位和检测其在不同周期的表达量变化,结合文献查找,推测其在MCF-7细胞周期调控中发挥的作用。本文研究的内容主要包括一下四个部分：第一部分：针对PinX1的CDS区设计合成引物。从外周血单个核细胞(PBMCs)中提取总RNA,通反转录PCR扩增获得目的基因片段。EcoR I/XhoI双酶切及T4连接酶连接将其插入PDsRedl-Cl质粒克隆微点中。通过质粒PCR及双酶切筛选并鉴定出阳性重组质粒,DNA送测序鉴定Pinx1序列的保真性,将成功构建的PDsRed1-C1-Pinx1真核表达载体转染癌细胞株MCF-7,以合适浓度G418进行筛选,获得稳定表达细胞。荧光定量PCR和Western-Blot验证Pinx1在稳定表达系中的表达情况。第二部分：通过细胞增殖(MTT法),细胞集落形成,计算后期染色体桥(anaphase-bridge)检测PinX1对乳腺癌细胞MCF-7的增殖,凋亡以及细胞周期的影响。第三部分：稳定表达系MCF-7细胞爬片后固定,DAPI染色,荧光显微镜下观察不同周期中Pinx1的定位；饥饿法收集不同周期的细胞,提取总RNA并逆转录成cDNA,荧光定量PCR检测不同周期中Pinx1的表达量。推测Pinx1在乳腺癌细胞MCF-7细胞中参与调节细胞周期的机制。上调Pinx1基因表达可以显著抑制MCF-7细胞的增殖,anaphase-bridge的计算结果从侧面证实Pinx1对MCF-7细胞增殖的抑制作用。Pinx1的定位观察实验发现了Pinx1在不同周期定位的差异,对Pinx1在不同周期的表达量检测揭示了Pinx1在不同细胞周期呈动态表达。本研究运用RT-PCR成功克隆其基因片段,构建得到PDsRed1-C1重组表达载体,转染MCF-7乳腺癌细胞进行持续、稳定表达。在MCF-7细胞中上调表达Pinx1,通过增殖,凋亡以及anaphase-bridge检测实验证实了Pinx1对MCF-7细胞增殖的抑制作用。Pinx1定位分析和荧光定量PCR表明Pinx1在细胞周期中表达量和定位都呈动态变化,结合已有研究初步推断Pinx1可能与丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PLK1(Polo-like kinase1)结合并被PLK1介导经泛素途径降解,从而调控细胞周期进程。这些都为将来进一步探讨Pinx1在乳腺癌中参与何种细胞通路从而抑制其增殖和调控其细胞周期的研究奠定了基础。