论文部分内容阅读
细胞非对称分裂是干细胞维持自我更新和发育时产生多样性的关键。在果蝇与线虫的研究中已经发现其调控机制和参与因子,很多因子在脊椎动物中也保守。简单来说,调控细胞非对称分裂的机制有两种,第一种称之为细胞内在调控机制,就是一些细胞命运决定因子非对称的分布到两个子代细胞进而决定其不同的分化命运。另一种被称作外在调控机制,子代细胞被安置在相应的环境中,由外界信号决定细胞的分化命运。对于细胞内在调控来说,主要分为四步：极性建立,细胞极化,命运决定因子非对称分布,纺锤体取向调控。Par3/Par6/aPKC复合物在极性建立,细胞极化,命运决定因子非对称分布调控中发挥了重要功能。G a i/LGN/NuMA/Dynein复合物则主要是在纺锤体取向调控中发挥作用。这两个复合物通过Insc联系在一起,Insc在体外和体内都可以与Par3和PinsTPR相互作用。新近有研究组研究发现另一条信号通路,即Pins/DLG/Khc73通路也在纺锤体取向调控中发挥了重要作用。但是这个通路在脊椎动物中是否保守,其分子作用机制又是怎样的,DLG在该通路中发挥了什么样的功能,都需要进一步研究。DLG属于一大类支架蛋白MAGUKs家族蛋白的DLG亚家族。MAGUK家族蛋白在组织发育、细胞沟通、细胞极性控制和细胞信号转导中发挥重要作用。虽然过去20多年对其展开了密集的研究,但是MAGUKs家族蛋白的鸟甘酸激酶结构域(GK)发挥功能的机制却不清楚,同时GK结构域在Pins/DLG/Khc73通路中怎样发挥功能也是一个谜。在本文中,我们揭示了DLG1/SAP97的GK结构域与细胞非对称分裂调控蛋白LGN (Pins的同源蛋白)的结合过程依赖磷酸化调控,由aPKC直接磷酸化LGNLinker的401位丝氨酸进而发挥调控作用。通过序列比对分析,我们找到了一段非常保守的Linker区域(aa.395-414),其中包含磷酸化位点Ser401。通过荧光偏振分析等手段测定结合强度,我们确定了p-LGNl8(395-414)是与DLG相互作用的位点,结合强度有0.22uM。随后,我们得到了P-LGN18多肽分别与SAP97-SH3GK和PSD95-SH3GK的复合物晶体,并解析了结构。根据复合物三维结构,我们对参与结合的关键残基做突变分析,证实了p-LGN N端和C端的残基在其与GK结构域的结合中的关键作用。比较分析SAP97-GK/p-LGN18, PSD95GK/GMP和酵母GK/GMP的晶体结构和相互作用作用界面残基,我们发现在酵母中的鸟甘酸激酶GK的GMP结合位点已经进化成为了一个特异的磷酸化丝氨酸和磷酸化苏氨酸(pSer/pThr)结合口袋。进一步实验研究表明,此前所报道的GK相关作用蛋白GKAP/DLGAP1/SAPAP1和SPAR与GK的相互作用也是依赖磷酸化调控的。通过对MAGUK家族蛋白进行序列比对分析,我们还预测CASK和MPPs同样是磷酸化依赖的调控机制,而Zo-1和DLG5则不是。MAGUK家族蛋白的GK/靶标相互作用的磷酸化依赖机制的发现表明该家族支架蛋白复合物的形成是一个动态的调控过程。磷酸化LGN与SAP97的结合为研究aPKC/LGNLinker/DLG通路奠定了基础。