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哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）是石斑鱼弧菌病主要病原,常引起患病鱼深层皮肤溃疡、胃肠疾病和眼部病变,导致石斑鱼高发病率和死亡率,造成重大经济损失。目前在石斑鱼养殖中主要应用抗生素治疗弧菌病,但抗生素的滥用导致耐药细菌的出现和药物残留等生态问题,影响石斑鱼的食品安全。疫苗接种是一种防控石斑鱼弧菌病和减少抗生素使用的替代选择,因此开发安全有效的哈氏弧菌疫苗将有较好的市场前景。本研究通过研究哈维氏弧菌鞭毛基体蛋白FlgE的免疫原性并制备亚单位疫苗和核酸疫苗,并通过添加壳寡糖和油佐剂进一步评价疫苗的效果,研究结果将为下一步研制抗弧菌商用型疫苗奠定基础。主要结果如下:（1）基于哈维氏弧菌全基因组中克隆flgE基因,生物信息学分析表明flgE基因全长1200bp,编码399个氨基酸,相对分子量为41.44 ku,理论等电点p I为4.58,无信号肽。亚细胞定位预测FlgE是一种细胞外蛋白,N-C端为一个FlgE超家族结构域。通过多重序列比对比较分析发现,FlgE氨基酸序列较为保守,与其它弧菌属同源性达到85%以上。将哈维氏弧菌flgE基因转入原核表达载体pET28a中构建重组表达载体pET28a-flgE,转入到大肠杆菌BL21（DE3）进行原核表达,对重组菌株表达时间、温度和异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG）浓度表达条件进行优化,使用镍柱亲和层析纯化获得重组FlgE蛋白,并通过SDS-PAGE和Western blotting分析和验证重组FlgE蛋白纯化效果。（2）将纯化后的重组FlgE蛋白用PBS稀释后与壳寡糖（Chitosan Oligosaccharide,COS）及油佐剂混合,用PBS组作为对照,设置PBS组、FlgE蛋白组、FlgE蛋白+COS组、FlgE蛋白+OIL组和FlgE蛋白+COS+OIL组腹腔注射免疫珍珠龙胆石斑鱼（♀E.fuscoguttatus×♂E.lanceolatus）,注射石斑鱼蛋白终浓度为25μg/尾,壳寡糖终浓度10μg/尾,油佐剂与抗原比例为7:3（W/W）。在免疫后第7、14、21、28、35和42d抽取的试验石斑鱼血液并离心获得血清,测定血清中过氧化氢酶（Catalase,CAT）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）和溶菌酶（Lysozyme,LZM）酶活性,通ELISA检测抗体效价;提取肝脏、头肾、脾脏及胸腺组织的总m RNA后应用qRT-PCR测定CD8-α、TNF-α和My D88等免疫相关基因的转录水平;最后用100μL 5.7076×10~8cfu/m L的哈维氏弧菌对免疫后6w的试验石斑鱼进行攻毒并观察14d内的死亡情况。结果显示,免疫后各疫苗组均能提高血清中CAT、SOD和LZM酶活性及Ig M特异性抗体的水平,且呈先上升后缓慢下降的时间依赖关系,含有COS组酶活水平和抗体较其它疫苗组上调更高,含有OIL佐剂的疫苗组在4-6w显著高于其他试验组,其中FlgE+COS+OIL组酶活和抗体水平在各时期均显著高于其他试验组。qRT-PCR结果显示免疫组相对对照组的免疫基因表达水平显著上调,FlgE组和FlgE+COS达到峰值的时间为3-4w。含油佐剂组达到峰值的时间为5-6w,表明不同佐剂的疫苗组能不同程度地刺激组织中免疫相关基因的表达,其中FlgE+COS+OIL组各免疫基因上调显著高于其他试验组。FlgE蛋白组、FlgE蛋白+COS组、FlgE蛋白+OIL组和FlgE蛋白+COS+OIL组相对免疫保护率RPS（Relative percent survival）分别为50%、66.6%、66.7%和77.7%。实验结果表明,重组亚单位疫苗FlgE能增强石斑鱼抗哈维氏弧菌的免疫保护力,且添加COS和OIL佐剂能进一步増强亚单位疫苗的免疫保护效果。（3）构建真核表达载体pcDNA3.1（+）-flgE,通过与COS及油佐剂的搭配设置pcDNA3.1组、p FlgE组、p FlgE+COS组、p FlgE+OIL组和p FlgE+COS+OIL组,注射石斑鱼质粒终浓度为25μg/尾,壳寡糖终浓度10μg/尾,油佐剂与抗原比列为7:3（W/W）。肌肉注射免疫石斑鱼后检测血清指标和组织中免疫基因转水平。免疫6w后使用100μL 5.7076×10~8cfu/m L的哈维氏弧菌攻毒,结果显示,相比于空质粒组,接种p FlgE组、p FlgE+COS组、p FlgE+OIL组和p FlgE+COS+OIL组的石斑鱼RPS分别为56%、68%、76%和88%。表明疫苗组能有效提高石斑鱼的免疫保护力,且p FlgE+COS+OIL组的免疫保护力在疫苗组中最高。免疫后各疫苗组石斑鱼血清中CAT、SOD和LZM酶活性水平显著高于对照组,其中p FlgE+COS+OIL组酶活性和特异性抗体的水平上调最高,显著高于其他试验组;其次是p FlgE+OIL,而p FlgE+COS组上调水平显著低于含油佐剂组,但仍显著高于单重组质粒组。ELISA显示疫苗组免疫1w后试验鱼血清中Ig M特异性抗体水平显著上调,p FlgE组、p FlgE+COS组、p FlgE+OIL组和p FlgE+COS+OIL组分别在第4w、4w、6w和第5w达到峰值;qRT-PCR结果显示试验组中石斑鱼免疫基因表达水平显著高于对照组,其中,接种p FlgE+COS+OIL疫苗的试验鱼免疫相关基因表达水平在整个试验时间内均显著高于其他试验组。