乳腺癌是临床上女性恶性肿瘤发病率最高的疾病之一,可对女性的生命健康造成严重危害,甚至危及生命。随着乳腺癌早期诊断策略和规范化多学科综合治疗技术的发展,乳腺癌患者死亡率逐渐下降,但发病率却逐年上升,在女性高发肿瘤中居首位。因此,对乳腺癌发生发展机制、临床早期诊断及预后疗效评价是目前国内外该病亟待解决的难点和研究的热点。人附睾蛋白4(HE4)是一种富含半胱氨酸的分泌性糖蛋白,自1991年Kirchhoff等学者发现至今,已先后发现其在卵巢癌、肺癌、乳腺癌等恶性肿瘤中均存在高表达。大量研究证实HE4在相关肿瘤血清学诊断上具有较高的灵敏度和特异性,能够较好地辅助临床进行诊断及预后判断。目前,国内外对HE4临床研究多集中于卵巢肿瘤血清学检测方面,并对其作用机制进行了初步探索,发现其与卵巢癌细胞的增殖、凋亡和侵袭等生物学特性相关。近年研究发现HE4在乳腺癌组织中也存在高表达,其表达与乳腺癌患者的淋巴结转移相关并可能是乳腺癌复发的一个预测因素,且CA153和HE4联合使用可明显提高临床乳腺癌诊断的敏感性和准确性,但目前HE4在乳腺癌发生发展中的生物学功能和作用机制尚未明确。乳腺癌的预防与治疗需要早期诊断技术的发展与相关分子作用机制的阐明。HE4作为一个日渐成熟的肿瘤诊断标志物,我国已经在一定范围内开展了HE4检测项目,其检测方法主要为酶联免疫法和化学发光法,但缺乏床旁快速检测及可在基层社区医院广泛应用的技术方法,严重阻碍了HE4在临床疾病筛查及诊断中的应用。因此,急需研发价格低廉的新型快速HE4诊断试剂。荧光免疫层析检测技术是一种新型的快速定量检测技术,具有灵敏度高、结果快速、价格低廉等特点,其性能指标远远高于其它快速检测技术,已逐渐成为诊断试剂研发的热点。为明确HE4在乳腺癌发展中的作用及相关机制,并为临床诊断提供有效的技术支持,本课题从以下两个方面对HE4进行研究:1.观察人乳腺癌组织和细胞株中HE4表达情况,构建慢病毒干扰载体,研究HE4基因沉默对乳腺癌细胞增殖、凋亡和迁移的影响及相关机制,观察其对裸鼠移植瘤生长的影响,为从分子水平上治疗乳腺癌提供一种新思路。2.采用基因工程及蛋白纯化技术获得HE4重组蛋白,并初步建立一种HE4荧光免疫层析检测方法,为国内HE4诊断试剂的研制提供一种新方法。第一部分乳腺癌组织和细胞中HE4的表达差异及构建HE4基因沉默乳腺癌细胞株目的:检测乳腺癌组织和细胞中HE4 m RNA及蛋白表达变化,通过构建慢病毒载体,获得HE4低表达乳腺癌细胞株,为下一步研究HE4在乳腺癌细胞中的作用及机制奠定基础。方法:1.收集浸润性乳腺癌组织及癌旁组织各30例,免疫组化检测HE4蛋白的表达变化。2.采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)和Western blot法检测HE4在人正常乳腺细胞Hs 578Bst及乳腺癌细胞MDA-MB-231、MCF7中的表达。3.构建HE4 RNAi慢病毒感染载体,感染MDA-MB-231乳腺癌细胞株,分别用Real-time PCR及Western blot法检测感染细胞中HE4基因及蛋白表达,获得HE4低表达乳腺癌细胞株。结果:1.免疫组化结果显示:HE4在浸润性乳腺癌组织与癌旁组织中均有表达,与癌旁组织相比,HE4在浸润性乳腺癌组织中表达显著升高(P<0.05)。2.Real-time PCR和Western blot结果显示:乳腺癌MCF7和MDA-MB-231细胞中的HE4表达水平均高于正常人乳腺细胞Hs 578Bst(P<0.05),并且在MDA-MB-231中的表达水平高于MCF7。因此,后续研究采用MDA-MB-231细胞株。3.成功构建HE4 RNAi慢病毒感染载体,经Real-time PCR和Western blot法验证在MDA-MB-231细胞株中的感染率约75%。结论:HE4在浸润性乳腺癌组织和细胞中表达均显著增加,提示其可能在乳腺癌发展中发挥重要作用。成功构建HE4基因沉默乳腺癌细胞株用于后续试验研究。第二部分HE4对乳腺癌细胞的作用及机制研究目的:采用HE4基因沉默MDA-MB-231乳腺癌细胞及裸鼠模型,探讨HE4对乳腺癌细胞增殖、凋亡和迁移的作用及相关机制。方法:1.采用MTT法检测HE4基因沉默对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的影响。2.采用细胞划痕和Transwell实验检测HE4基因沉默对乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移的影响。3.采用TUNEL染色和流式细胞术检测HE4基因沉默对乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的影响。4.采用Western blot法检测HE4基因沉默对乳腺癌MDA-MB-231细胞ERK、p-ERK、p-c-Jun、c-Fos、p-Akt、Akt、cleaved caspase-3、caspase-3、MMP-2和MMP-9蛋白表达的影响。5.建立裸鼠移植瘤模型,观察HE4基因沉默对乳腺癌MDA-MB-231细胞致瘤能力的影响。6.采用HE染色观察成瘤细胞的形态变化及免疫组化法观察HE4、MMP-2和MMP-9蛋白表达变化。结果:1.MTT结果显示:与对照组相比,HE4基因沉默导致细胞增殖能力显著降低(P<0.05)。2.细胞划痕实验结果显示:与对照组相比,HE4基因沉默后细胞愈合能力显著变弱(P<0.05);Transwell实验结果显示:与对照组相比,HE4基因沉默后细胞迁移数显著下降,迁移能力降低(P<0.05)。3.流式细胞术及TUNEL染色结果显示:与对照组相比,HE4基因沉默后细胞凋亡数显著增加(P<0.05)。4.Western blot结果显示:与对照组相比,HE4基因沉默导致相关蛋白p-ERK、p-c-Jun、c-Fos、p-Akt、MMP-9和MMP-2表达量降低(P<0.05),cleaved caspase-3表达量升高(P<0.05)。5.裸鼠移植瘤模型结果显示:与对照组相比,细胞移植后HE4基因沉默组体内瘤体生长缓慢,5天后瘤体积开始出现明显差异(P<0.05)。6.免疫组化结果显示:与对照组相比,HE4基因沉默组HE4、MMP-2和MMP-9蛋白表达均显著降低(P<0.05)。结论:HE4基因可能通过ERK-Jun-Fos和Akt信号通路对乳腺癌细胞增殖、凋亡和迁移产生影响;HE4基因沉默对裸鼠移植瘤模型中肿瘤生长具有明显的抑制作用。第三部分HE4荧光免疫层析检测方法的建立及初步评价目的:采用基因工程技术制备HE4重组蛋白,用于室内参考品的建立;初步建立HE4荧光免疫层析检测方法。方法:1.构建HE4原核表达重组菌BL21-pET32-HE4,并对HE4重组蛋白诱导表达条件进行优化及免疫原性检测。2.采用镍离子交换层析法纯化HE4重组蛋白并检测其纯度。3.采用市售试剂盒对HE4重组蛋白进行标定,制备出一套本实验室用参考品,并对制备的参考品稳定性进行验证。4.建立HE4荧光免疫层析检测方法并初步进行性能评价。通过对硝酸纤维素膜,EDC用量、标记抗体用量、包被抗体用量及偶联微球稀释倍数的选择优化,确定HE4荧光免疫层析检测方法相关工艺,并对检测方法的线性范围、精密性、稳定性和回收率进行评价。选取40份HE4临床血清,进行检测方法的对比实验,评价其检测效果。结果:1.获得HE4蛋白原核表达菌BL21-p ET32-HE4,并确定蛋白最佳诱导表达条件:IPTG浓度0.2 mmol/L,温度37℃,时间3 h,实现了HE4蛋白的可溶性表达。采用SDS-PAGE检测纯化后HE4重组蛋白纯度达90%以上。2.制备出一套线性参考品(15 pmol/L、150 pmol/L、300 pmol/L、750 pmol/L、1500 pmol/L),一套线性范围参考品(5 pmol/L、10 pmol/L、15pmol/L、50 pmol/L、150 pmol/L、300 pmol/L、750 pmol/L、1000 pmol/L、1200 pmol/L、1500 pmol/L、1800 pmol/L、2000 pmol/L)及一份精密性参考品750 pmol/L。稳定性结果显示参考品在4℃保存7天及-80℃保存半年稳定性良好。3.确定HE4荧光免疫层析检测方法相关工艺:硝酸纤维素膜:No.01;EDC加入量:1μL固含量为1.05%的荧光微球对应的EDC用量为8μg;标记抗体量:1μL固含量为1.05%的荧光微球对应的标记抗体用量为5μg;T线包被抗体量:1.5 mg/m L;偶联微球稀释倍数:300倍。线性范围:15-1500 pmol/L;批内精密性:7.9%;批间精密性:9.8%;稳定性:37℃稳定保存7 d;高、中、低值参考品回收率分别为99.75%、99.8%、96%。4.与罗氏检测试剂同时检测40份HE4血清,结果表明两者相关性较好,回归方程:Y=0.9286x+26.737,R2=0.9462。结论:采用基因工程及蛋白纯化技术成功获得HE4重组蛋白,并以该蛋白标定出一套室内用参考品;初步建立HE4荧光免疫层析检测方法,为后续HE4荧光免疫层析检测方法的最终建立提供了技术保障。