论文部分内容阅读
目的：肝细胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC)仍是严重威胁我国人民生命健康的常见恶性肿瘤,目前总体疗效与患者生存率还不能令人满意。其高度的异质性是其较其他实体肿瘤更易发生转移复发的主要原因。肿瘤的异质性意味着肿瘤中存在一小部分具有“干性”潜能的肿瘤干细胞(Liver cancer stem cell, LCSCs),其具有许多如无限增殖、自我更新、免疫缺陷小鼠体内成瘤以及自我分化和致瘤能力等干细胞生物学特性。现有研究发现CD133、CD9、CD13、CD24、CD44和上皮细胞粘附分子(EpCAM)等可作为肝癌干细胞(LCSCs)的表面标记,而Notch、Wnt/β-catenin1-3 Hedgehog信号通路等常在干细胞的自我更新与分化发育中起重要作用。因此,本研究拟首先观察肝癌标本中上述不同LCSC表面标记的表达与临床预后及病理特征之间的关系。再检测浮球培养富集的肝癌干细胞的表面标记表达情况,并通过一系列“干性”鉴定实验和干性基因的检测鉴定其“干性"特征,进一步通过一组干预与调控研究探讨Notch和Wnt/β-catenin信号通路在肝癌干细胞(LCSCs)“干性”维持中的作用和机制。方法：我们首先采用免疫组织化学(IHC)技术检测61例肝癌标本中具有代表性的肝癌干细胞表面标记CD90、CD44、CD133、 CD13和CD24的表达水平,并与临床病理特征之间的相关性进行多变量分析。其次我们应用3D浮球培养条件培养肝癌细胞,连续传代3次以上,筛选出活性较好的细胞,并用流式细胞仪检测上述4个肝癌干细胞的表面标记分子(CD90, CD24, CD133和CD13)的表达情况。然后通过克隆形成实验、NOD／SCID免疫缺陷小鼠成瘤实验来检测浮球培养富集的肝癌干细胞的体内外自我更新及转移能力。并通过定量RT-PCR和Western blot检测相关“干性”基因(NANOG,OCT3/4,SOX2和BMI-1)与EMT相关基因(Vimentin,E-cadherin,Snail和Twist)的表达状况。进一步分别使用XAV939抑制浮球培养富集的肝癌干细胞的Wnt/β-catenin、以及Wnt配体Wnt3a或BIO激活Wnt/β-catenin信号通路等干预手段,检测干预后Notch通路活性的变化；再观察分别用γ分泌酶抑制剂-BMS-708163.DAPT或慢病毒LV-ShRNA Notch抑制Notchl信号通路后Wnt信号通路活性的变化,最后用慢病毒LV-Notchl过表达Notchl,检测上调Notch1后Wnt/β-catenin通路的活性,探讨两条通路间在维持肝癌干细胞“干性”中的作用,并探索二者间是否存在串话关系以及上下游关系等分子机制。结果：(1)Kaplan-Meier生存分析显示,与原位肿瘤中CD90CD24CD13CD133-/低表达的患者相比,CD90CD24CD13CD133+／高表达的患者总体生存率和无病生存率明显减低；(2)肝癌中CD90CD24CD13CD133+的表达率高不仅与疾病分期较晚呈正相关,而且还与肿瘤体积和肿瘤分期呈正相关；(3)logistic回归分析表明肝癌患者CD90CD24CD13CD133+的表达与肿瘤的分化程度呈负相关性；(4)浮球培养富集的肝癌细胞中CD90、CD24、CD133和CD13等肝癌干细胞表面标记的表达都有不同程度的上调；(5)源于PLC/PRF/5和Huh7(肝细胞癌的细胞系)的浮球培养富集的肝癌干细胞其克隆形成率显著高于亲代细胞,裸鼠成瘤实验显示比亲代肿瘤细胞的成瘤率更高、成瘤时间更早、成瘤肿瘤体积更大、转移发生率更高,且相关“干性”基因(NANOG,OCT3/4,SOX2和BMI-1)和EMT相关基因(Vimentin,E-cadherin,Snail和Twist)表达水平更高;(6)Notch信号通路和Wnt/β-catenin信号通路在浮球培养肝癌干细胞中的表达均明显升高;(7)DAPT、XAV939分别抑制Notch和Wnt/β-catenin都能显著抑制肝癌干细胞的克隆形成、侵袭转移能力、NOD/SCID免疫缺陷小鼠的体内成瘤与转移能力以及相关干性基因(NANOG和SOX2)的表达；(8)采用XAV939抑制浮球培养富集的肝癌干细胞的Wnt/β-catenin信号通路后其Notch配体Jaggedl.受体胞内域NICD.靶基因Hes1的表达明显减低;(9)应用Wnt配体Wnt3a或BIO激活其Wnt/β-catenin信号通路后,其Notchl受体胞内域NICD和配体Jaggedl的表达均升高；(10)反过来我们用Y分泌酶抑制剂——BMS-708163或慢病毒LV-ShRNA Notch抑制浮球培养富集的肝癌干细胞的Notchl信号通路后,Wrt/β-catenin信号反而升高；(11)再用慢病毒LV-Notchl过表达上调其Notchl信号通路后其β-catenin的表达增加。结论：我们的研究显示：(1)联合检测LCSCs的表面标记可作为一个有前景的预测HCC患者预后的技术手段;(2)Notch和Wnt/β-catenin信号通路可能在多标记(CD90 /CD24/CD13/CD133)阳性的肝癌干细胞的自我更新维持中起至关重要的作用;(3)Notch和Wnt/B-catenin信号通路在维持CD90、CD24、CD13和CD133高表达的浮球培养富集的LCSCs的自我更新中发挥关键作用,Notchl信号通路可能是Wnt/β-catenin信号通路的下游,Notchl负向调控Wnt/β-catenin信号通路,而且在这两个信号通路之间可能存在一个非蛋白酶介导的反馈循环。该研究从Notch和Wnt/B-catenin信号通路参与肝癌干细胞“干性”维持这一角度进一步完善了肝癌的侵袭转移机制,可望为从调控肝癌干细胞“干性”出发阻遏肝癌的转移复发提供新的治疗靶点和策略。