论文部分内容阅读
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,S.aureus）是一种广泛存在于自然界中的革兰氏阳性细菌,经常污染蔬菜、肉类等食品,严重威胁人们的生命健康。因此,建立准确有效的检测方法对于监控和预防S.aureus引起的食品安全问题具有重要意义。但复杂的食物基质会严重影响检测方法的灵敏度和准确度,而将磁分离（Magnetic separation,MS）等前处理技术应用于样本的前处理过程中,可以有效消除基质对检测方法的干扰。在致病菌磁分离时,常用识别致病菌的分子主要包括抗体、适配体、抗生素、含硼酸根的分子等。其中硼酸盐衍生物3-氨基苯硼酸盐酸盐（3-Aminophenyl boronic acid hydrochloride,APBA）,可以通过可逆酯化作用与细菌表面的邻二羟基基团结合,相较于抗体或抗生素等识别分子,APBA具有相似的与致病菌结合能力、稳定、易于制备、价格低廉等优点。本研究以APBA作为识别分子,并通过“直接”和“间接”偶联的方式制备功能化磁珠（Magnetic beads,MBs）,对加标样本中的S.aureus分离富集,并结合比色法（MS-比色法）和荧光法（MS-荧光法）对S.aureus进行灵敏、准确检测。各章节的内容如下:第一章综述了用于MS技术的识别分子种类、偶联方式以及APBA在食源性致病菌检测中应用的研究进展。第二章:为了实现对样本中S.aureus的分离及检测,研究建立基于MBs-APBA结合比色法检测S.aureus的方法。通过“直接”偶联方式制备用于分离富集S.aureus的MBs-APBA,进一步联合辣根过氧化物酶标记的猪免疫球蛋白G（Horseradish peroxidase-pig immunoglobin G,HRP-pig Ig G）,形成“三明治”结构复合物（HRP-pig Ig G@S.aureus@APBA-MBs）,催化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine,TMB）发生显色反应,并优化HRP-pig Ig G用量及孵育时间,实现对S.aureus的比色检测。在最优条件下,对PBS中S.aureus的捕获效率（Capture efficiency,CE）大于95.3%,APBA-MBs对菠菜、果汁和池水加标样中S.aureus的CE分别大于92%、90.5%和94%。MS-比色法在果汁、池水和菠菜中的检测限（Limit of detection,LOD）均为3.0×10~2CFU/m L。本研究制备的MBs-APBA对S.aureus具有分离、富集能力,联合比色法可以对S.aureus进行灵敏检测。第三章:为了降低对样本中S.aureus富集、分离的成本,并进一步缩短检测时间,研究建立基于MBs-PEG-APBA结合荧光法检测S.aureus的方法。通过“间接”偶联方式,将PEG作为介导物,制备用于分离富集S.aureus的MBs-PEG-APBA,进一步联合异硫氰酸荧光素标记的猪免疫球蛋白G（Fluorescein Isothiocyanate-pig immunoglobin G,FITC-pig Ig G）,形成“三明治”结构复合物（FITC-pig Ig G@S.aureus@APBA-PEG-MBs）,并优化FITC-pig Ig G用量及孵育时间,实现对S.aureus的荧光检测。在最优条件下,APBA-PEG-MBs对PBS中S.aureus的CE大于94.2%,对菠菜、果汁和池水加标样中S.aureus的CE分别大于92.6%、91.6%和91.6%。MS-荧光法在菠菜、果汁和池水加标样中对S.aureus的LOD均为2.7×10~2 CFU/m L。此外,与MS-比色法相比,本研究有效减少了MBs的用量（约30%）和缩短了检测时间（约20 min）。本研究制备的MBs-APBA具有对S.aureus低成本分离、富集能力,联合荧光法可以对S.aureus进行灵敏、快速检测。第四章:为了方便将APBA磁分离方法用于实际检测中S.aureus的富集分离,本研究组装苯硼酸磁分离试剂盒。通过评价试剂盒富集分离不同样本中S.aureus的性能以及重复性、稳定性以及储存时间等指标,组装了苯硼酸磁分离试剂盒。在最佳条件下,批内、批间的试剂盒对S.aureus的CE均为90%,在保存175天后,对加标样中S.aureus具有93%的CE。本研究开发的试剂盒具有较好的稳定性、重复性,可以分离富集不同样本中的S.aureus。综上所述,本研究制备的APBA磁性纳米材料对食品样本中的S.aureus具有较好的富集分离效率,并结合比色和荧光法可以实现对S.aureus的灵敏、快速检测。在进一步的研究中,开发的APBA磁分离试剂盒,具有较好的重复性、稳定性、保存期,可以富集分离不同样本中的S.aureus。本研究能够为磁分离技术在S.aureus的监测中提供参考。