论文部分内容阅读
真核细胞中的许多生命活动都是由复杂的蛋白质复合体完成的,为更好地研究这些复合体非常有必要建立一套能高效稳定地表达这些蛋白质复合体的真核生物共表达系统。酵母一直被认为是一种理想的真核表达系统,但由于缺乏非常有效的共表达体系,使得应用酵母来表达这些细胞内的蛋白质复合体比较困难。近年来,FMDV(foot-and-mouth disease virus)中的2A短肽在动物细胞中构建共表达载体上得到了广泛应用,促成了一系列基于2A短肽的共表达载体。本研究的主要目的就是建立2A短肽介导的毕赤酵母共表达系统,并基于此系统和双分子荧光互补(BiFC)原理发展体内研究蛋白质相互作用的酵母系统。
在共表达系统的建立中,选择易于检测的两种荧光蛋白作为目标蛋白。通过基因拼接,分别将GFP、2A短肽和Mcherry编码序列克隆至毕赤酵母分泌型表达载体和胞内表达载体pPIC9K和pPIC3.5K中,在甲醇的诱导下进行表达。结果表明,在pPIC9k载体中,GFP被分泌到胞外表达而Mcherry在胞内得到了表达;在pPIC3.5k载体中,两荧光蛋白都在胞内得到了表达。由此说明,利用pPIC9k和pPIC3,5载体,本研究成功构建了2A短肽介导的酵母共表达系统。
本研究在2A短肽介导的酵母共表达系统基础上,同时结合红色荧光蛋白Mcherry的BiFC效应发展了蛋白质相互作用的酵母系统。将SV40大T抗原和P53分别融合在Mcherry荧光蛋白的MN片段和MC片段上,诱导表达后,在荧光显微镜下观察到较强的荧光信号。
本研究建立的2A短肽介导的酵母共表达系统,可以使两种蛋白在毕赤酵母中高效表达。基于此发展的蛋白质相互作用研究系统,可以实时、在体(酵母细胞)观测蛋白质相互作用情况,具有较为重要的科学意义和实际应用价值。