论文部分内容阅读
研究背景:恶性肿瘤,仅次于心脑血管事件,在中国其发病率和死亡率位居第二。中国作为一个发展中国家,不同癌症的发病率与发达国家不同,其占据最主要的地位仍是肺癌,而乳腺癌在全球女性中的发病率均见明显升高。随着医疗技术的进步,对肺癌患者可以进行手术治疗、介入治疗、放化疗治疗,但我国肺癌患者的5年生存率仍然仅为19.7%。许多患者在被诊断时已处于疾病进展期,错过了最佳的治疗时机,增大了治疗的难度。因此我们需要更简便,易于推广至基层医疗单位的肿瘤筛查指标,以提高肿瘤的早发现,早诊断,早治疗。目前国际上研究表明平足蛋白(podoplanin,PDPN)在许多肿瘤组织中高表达。PDPN是一种存在于多种哺乳动物体内的小分子唾液酸粘蛋白,是体内血小板新型凝集素样受体-2(CLEC-2)的唯一配体,在正常人体组织中,其主要表达在淋巴内皮管上,在成骨细胞、肺泡细胞上也有少量表达,并在胚胎肺部发育、肾脏发育中起重要作用。PDPN作为血小板膜上CLEC-2的配体,为肿瘤细胞和血小板之间的相互作用架起一座桥梁,PDPN通过作用血小板,增加了肿瘤转移的可能性和相关血栓形成。近来,许多学者使用PDPN单抗D2-40对多种人恶性肿瘤标本进行染色注意到PDPN在肿瘤组织和转移组织中的高表达,如黑色素瘤,胶质瘤,骨肉瘤等等。为了探索PDPN在肿瘤诊断、发生和转移中的作用,本室以PDPNPLAG区偶联血蓝蛋白(KLH)作为免疫原,制备了两株抗PDPN的小鼠源单克隆抗体SZ-163和SZ-168,其中SZ-168抑制高表达PDPN的肿瘤细胞诱导的人血小板聚集,并可以抑制小鼠体内种植的人恶性黑色素瘤肿瘤细胞C8161所致肿瘤的生长和转移。同时本室以SZ-163和SZ-168建立了双抗体夹心法测定人血浆可溶性PDPN(sPDPN)酶联免疫吸附(ELISA)方法,虽然初步检测出癌症患者sPDPN水平显著高于正常人,但该方法存在包板抗体——SZ-163产量低等问题,难于大批量生产和推广使用。故本研究希望对该方法进行改进并测定了肺癌和乳腺癌患者血浆内的sPDPN的水平,期待能在临床推广应用,对肿瘤及转移患者的诊断,分型起着指导作用。目的:重新将SZ-163原代细胞株进行三次单克隆化,筛选出一株高产、稳定,且能与SZ-168抗体建立稳定ELISA试剂盒的单克隆抗体,并应用于肺癌和乳腺癌患者,检验血浆sPDPN是否能在肺癌和乳腺癌患者的诊断中发挥作用。方法:(1)用CHO-hPDPN、PDPN多肽、CHO细胞包板的酶标板筛选复苏的SZ-163原代杂交瘤细胞,再经三次单克隆化后筛选所得高产的阳性细胞株,体内诱生法原理使小鼠产生大量腹水,亲和层析纯化抗体IgG。(2)利用间接ELISA法和免疫印迹实验(Western Blot,WB)鉴定所得抗体能否识别并结合CHO-hPDPN、PDPN多肽、CHO细胞、含PDPN的黑色素瘤细胞C8161的特异性。(3)将所得抗体SZ-163-8C12-3-IgG包板,加入预先收集到的苏州大学附属第一医院的50例女性供干细胞者和50例乳腺癌患者的血浆,重组人PDPN全长多肽作标准品,二抗为辣根过氧化物酶标记的SZ-168(SZ-168-HRP),拟合标准曲线,摸索该方法的最佳线性范围、最低检测限、生物检测限度和灵敏度。并用Pearson相关分析和Bland-Altman一致性分析认识与原163方法测量结果的联系,接受P<0.05为差异具有统计学意义。于病理科收集到上述浸润性乳腺癌患者手术标本40例,对其切片进行苏木素-伊红染色(HE染色),并通过抗PDPN单抗D2-40进行免疫组化染色(IHC),结合其他临床参数,观察分析染色结果。(4)收集南京军区福州总医院的正常体检者、肺炎患者与肺癌患者的血浆,比较3组sPDPN水平是否存在差异。分析sPDPN能否将肺癌患者从其他人群中区分开?诊断价值如何?是否是肺癌的独立预测相关指标?肺炎患者中的sPDPN水平?均接受P<0.05为差异具有统计学意义。结果:(1)通过对SZ-163原代细胞进行三次单克隆化成功筛选获得一株高产的稳定阳性杂交瘤细胞——SZ-163-8C12-3,平均约收取2ml腹水/小鼠,纯化到纯品抗体3mg IgG/ml腹水,是原来SZ-163产量的8倍。(2)ELISA结果提示:SZ163-8C12-3与CHO-hPDPN和PDPN多肽的效价在62.5ng/ml 和 125ng/ml,且不与 CHO 细胞反应。在 WB 试验中,SZ-163-8C12-3 和 SZ-168一样,能识别天然C8161细胞表面的PDPN,而普通小鼠IgG不能。(3)SZ-163-8C12-3作为包板抗体,可拟合出R2=0.995的标准曲线最佳线性范围在0.9765625ng/ml-250ng/ml,最低检测限为0.65ng/ml,生物检测限度为0.91ng/ml,灵敏度为0.65ng/ml。检测正常对照组(n=50)sPDPN含量为(1.14±0.22)ng/ml,乳腺癌组(n=50)SPDPN含量为(22.23±2.68)ng/ml,P<0.001。SZ-163-8C12-3包被法与SZ-163包被法所测得的结果相关性好、一致性好。结合HE染色,IHC结果提示部分乳腺癌患者的组织中有PDPN高表达,按年龄、临床分期、分化程度、是否有淋巴结转移等对乳腺癌患者进行分类,结果显示Ⅲ-Ⅳ期、伴有淋巴结转移、雌激素受体阴性、孕激素受体阴性的患者组织PDPN阳性率要高于Ⅰ-Ⅱ期(P=0.022)、无淋巴结转移(P=0.042)、雌激素受体阳性(P=0.010)、孕激素受体阳性(P=0.037)者。而组织PDPN阳性组的sPDPN含量显著高于阴性组[(23.74±2.71)ng/ml vs(21.09±1.89)ng/ml,P=0.003],ki67 标记率亦高于阴性组[(57.14±12.54)%vs(21.54±8.86)%,P<0.001]。(4)52例肺炎组患者和105例肺癌组患者血浆sPDPN水平分别为(5.17±2.81)ng/ml 和(19.96±6.26)ng/ml,与 61 例正常组(1.37±0.55)ng/ml 比较,肺癌组肺癌患者的sPDPN水平高于肺炎组(P<0.001)和正常对照组(P<0.001),肺炎组的sPDPN水平高于正常对照组(P<0.001)。肺癌患者中,临床分期晚、肿瘤细胞分化程度低和伴有转移的患者的sPDPN水平要明显高于分期早(P=0.010)、分化好(P=0.010)、无转移的患者(P=0.015)。sPDPN的诊断效能要优于常用的肺癌肿瘤指标CEA、CYF211,拥有最大的曲线下面积(AUC)达0.986,敏感度0.914,特异度0.992;且在调整混杂后,是OR值达4.148的肺癌独立预测指标。而在肺炎患者中,sPDPN的水平和降钙素原(PCT)含量相关,Pearson相关系数达0.798,P<0.05,而与超敏C反应蛋白(hsCRP)不相关(Pearson系数=0.217,P=0.122)。结论:(1)成功筛选获得一株高产的小鼠抗人PDPN单克隆抗体SZ-163-8C12-3,SZ-163-8C12-3不仅结合人工转染的CHO-hPDPN细胞且能识别天然肿瘤细胞中PDPN。(2)SZ-163-8C12-3可与SZ-168成功建立测定人sPDPN-双抗夹心ELISA方法。(3)乳腺癌患者血浆存在高水平的sPDPN,部分患者肿瘤组织内高表达PDPN,可初步区分出临床分期晚、伴有淋巴结转移的、雌激素受体阴性、孕激素受体阴性和ki67标记率高的患者。(4)肺癌患者血浆存在高水平的sPDPN,与CEA、CYF211相比,sPDPN具有最大的曲线下面积,以及诊断肺癌的最高的灵敏度和特异度,并是肺癌的独立预测因子。提示了 sPDPN作为肺癌筛查指标的临床应用价值,并可初步评估临床分期,分化程度和转移情况。(5)肺炎患者血浆中sPDPN也有升高(不及肺癌患者),并与PCT相关,可能与体内炎症反应有关。