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目的构建肠道病毒71型双中和抗原表位嵌合型人3型腺病毒载体，为人3型腺病毒衣壳嵌合载体的应用及基因工程疫苗的研究奠定基础。方法以前期构建的人3型腺病毒骨架质粒pBRAd△E3GFP-sp70为模板，搭桥PCR扩增六邻体不同超变区（HVR）同时嵌入EV71的SP55和SP70两个中和表位的六邻体突变基因片段hexon-sp55sp70，突变的六邻体片段克隆入穿梭载体，酶切后与线性化的人3型腺病毒骨架质粒pBRAd△E3GFP共同转化大肠杆菌BJ5183，同源重组获得阳性重组腺病毒质粒pBRsp70sp55Ad3egf，经PCR、酶切及测序鉴定并线性化后转染AD293细胞拯救重组腺病毒。重组腺病毒经大量扩增纯化后，进行热稳定性实验和生长稳定性实验分析病毒的特性，Western blot和ELISA实验分析嵌合表位在六邻体上的表达及在重组腺病毒粒子表面的暴露情况之后，用重组腺病毒免疫BALB/c小鼠，通过Western blot，ELISA实验检测免疫小鼠的体液免疫反应，微量中和实验检测抗血清体外中和EV71病毒的活性。结果在SP70嵌入六邻体HVR1区的基础上，SP55嵌入六邻体HVR4区和HVR5区的重组腺病毒质粒未能成功拯救出重组病毒，而SP55嵌入HVR2区成功拯救出重组腺病毒R1R2A3，而且没有影响病毒的热稳定性和生长特性。SP55、SP70表位在六邻体蛋白融合表达并且暴露在病毒粒子表面。重组腺病毒初次免疫小鼠即诱导出SP55、SP70表位特异性抗体，多次免疫后抗体应答加强。重组腺病毒较SP70-GST，SP55-GST融合蛋白免疫小鼠诱导产生更高滴度的IgG抗体，并且重组腺病毒免疫的抗血清能够体外中和EV71病毒感染。结论成功构建表达双中和抗原表位嵌合型人3型重组腺病毒，免疫小鼠后诱导出表位特异的体液免疫反应，本实验拓宽了六邻体衣壳蛋白修饰的3型腺病毒作为多个外源表位展示载体工具的应用，为其以后应用于双价或者多价疫苗打下了良好的基础。