【摘 要】
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具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum,F.nucleatum）是一种条件致病菌,主要寄生于人类或多种哺乳动物口腔和消化道中,能够引起牙周炎、牙髓坏死、绒毛羊膜炎、早产、新生儿败血症、脓肿、结直肠癌等感染性疾病。目前F.nucleatum的检测手段主要包括细菌的分离培养与鉴定、酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）、聚
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目（编号:31870989）；
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具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum,F.nucleatum）是一种条件致病菌,主要寄生于人类或多种哺乳动物口腔和消化道中,能够引起牙周炎、牙髓坏死、绒毛羊膜炎、早产、新生儿败血症、脓肿、结直肠癌等感染性疾病。目前F.nucleatum的检测手段主要包括细菌的分离培养与鉴定、酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）、聚合酶链式反应（PCR）、实时荧光定量PCR技术（Quantitative Real-time PCR,qPCR）等,但是这些方法都在不同程度上存在着费时费力或操作复杂或灵敏度不高等缺点,因此临床检测中亟需一种快速、简单、高灵敏的F.nucleatum检测手段。本研究建立一种磁纳米探针（Magnetic nanoparticle probe,MNP probe）标记F.nucleatum的暗场显微计数法,可快速灵敏地定量检测样本中的F nucleatum。本研究主要包括以下几个部分:1、抗F.nucleatum多克隆抗体的制备与鉴定利用甲醛灭活F.nucleatum菌体作为抗原免疫BALB/c小鼠以制备抗F nucleatum多克隆抗体血清。经ELISA方法确定其血清效价为1:128000,血清纯化后通过SDS-PAGE实验检测纯化效果,结果显示非目的蛋白条带减少,表明纯化效果良好。后通过ELISA实验证明纯化后的多克隆抗体可与F.nucleatum特异性反应,而不与非目标细菌反应。2、qPCR定量检测F nucleatum方法的建立根据F nucleatum特异性保守基因nusG设计并合成qPCR特异性引物,构建含有目的基因的重组质粒作为标准质粒。以F.nucleatum基因组和阴性对照组细菌的基因组作为模板进行qPCR反应,结果显示仅F.nucleatum基因组有目的基因扩增,表明引物特异性良好。以梯度稀释的标准质粒进行qPCR反应,绘制qPCR反应的标准曲线,方程为Y=-3.373X+42.77（Y为Ct值,X为质粒拷贝数的对数）,相关系数R2=0.9982,表明标准曲线线性关系良好。通过建立的qPCR方法对F.nucleatum定量检测并确定检测限,结果显示该方法的检测限为1.71×102 copies/μL且检测时间约为1.5 h。3、磁纳米探针结合暗场显微镜定量检测F.nucleatum方法的建立（1）MNP探针的制备和表征:采用粒径为50nm且表面修饰有Protein G的磁纳米颗粒（Magnetic nanoparticles,MNPs）偶联抗F.nucleatum多克隆抗体制备成可以特异性捕获F.nucleatum的MNP探针。经SDS-PAGE实验和透射电子显微镜（Transmission electron microscope,TEM）观察,结果表明MNPs与抗体成功偶联且单分散性良好,即探针制备成功。（2）MNP探针结合暗场显微镜检测F.nucleatum:将F.nucleatum与MNP探针共同孵育后,在暗场显微镜可以观察到明亮的梭状结构,明显区别于暗背景和阴性对照。TEM观察结果显示MNP探针仅紧紧围绕在F.nucleatum周围,表明MNP探针只能特异性捕获F.nucleatum,明亮的梭状结构是由于MNP探针结合在F.nucleatum表面所形成。通过建立的MNP探针-暗场显微计数法对F.nucleatum进行定量检测,计数结果与qPCR方法检测结果保持一致。其检测限为3.14×101 copies/μL,检测时间约为30min。通过比较,MNP探针-暗场显微计数法比qPCR方法的灵敏度高5倍左右,且检测时间约为qPCR的1/3。为了测定该检测方法对实际样本中Fnucleatum的准确性和灵敏度,以灌肠的方式用F.nucleatum感染C57BL/6J小鼠,采集其结直肠组织作为实际样本,用MNP探针-暗场显微计数法和qPCR方法对样本中的F.nucleatum进行定量测定。结果显示两种方法的检测结果保持一致,但MNP探针-暗场显微计数法耗时短,仅需30 min。综上所述,本研究所建立的基于MNP探针-暗场显微计数的F.nucleatum检测方法操作简便、耗时短（约30 min）、灵敏度高且可用于实际检测,为F.nucleatum的超灵敏检测提供了一种新的技术,具有应用于临床样本检测及现场检测的前景。
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