引言：长期以来动脉粥样硬化（Atherosclerosis，As）一直被认为是内膜炎症性疾病，血管外膜仅对血管起营养、支持作用。但最近研究发现：血管外膜对血管功能具有重要的调节作用，外膜存在的交感及副交感神经末梢释放神经递质如去甲肾上腺素、神经肽Y、P物质、乙酰胆碱、一氧化氮等可作用于中膜平滑肌细胞，调节血管舒缩功能。外膜的主要细胞成分成纤维细胞在病理状态下可被激活，发生表型转化、增殖、迁移并合成多种细胞因子，参入多种疾病的发生、发展。进一步研究血管外膜将有助于全面认识血管疾病的病理生理机制，拓展对血管病变的防治方法。已有研究证实As中存在着血管外膜炎症，而且血管外膜的炎症细胞浸润与As的病变程度呈正相关，也有报道血管外膜炎症与内膜增生及急性冠脉综合征的发生有关。动脉外膜的滋养血管可能是炎症细胞侵入血管壁的门户。但目前关于As血管外膜炎症发生的机制尚不清楚，外膜成纤维细胞在外膜炎症发生中的作用以及他汀类药物在降脂作用外能否抑制血管外膜炎症等问题国内外研究很少，为此，我们通过动物实验及细胞培养系列研究探讨血脂与As血管外膜炎症及成纤维细胞表型转化、增殖和炎症因子合成的关系以及氟伐他汀的干预作用。论文Ⅰ动脉粥样硬化家兔血脂与血管外膜变化的关系及氟伐他汀干预作用的研究背景：越来越多的证据表明血管外膜炎症可能是As发生、发展的原因之一，外膜浸润的炎症细胞分泌多种细胞因子和粘附分子，不仅可影响内膜的变化诱发As的发生，还可以通过神经末梢及直接作用于平滑肌受体影响中膜，促进As的发生、发展。血脂异常与As形成具有肯定的关系，既往的研究主要针对高胆固醇血症（Hypercholesterolemia，HC）尤其是氧化低密度脂蛋白（Oxidized low-dentity lipoprotein，ox-LDL）对血管内膜的影响，但有关血脂异常对As血管外膜的影响及他汀类药物干预作用的研究国内少见报道，为此，我们通过高脂饮食建立As模型，探讨血脂与血管外膜变化的关系以及氟伐他汀的干预作用。目的：高脂饮食建立As模型，探讨：①血脂异常与血管外膜炎症细胞浸润、外膜成纤维细胞表型转化以及核因子КBp65（Nuclear factor Kappa B，NF-Kappa B）活性的关系；②外膜炎症细胞浸润与As病变程度的关系；③成纤维细胞NF-КBp65活性与其表型转化的关系；④氟伐他汀对As外膜炎症细胞浸润及成纤维细胞表型转化和NF-КBp65活性的影响。方法：（1）建立As模型：选择健康雄性新西兰家兔34只，随机分为①对照组10只：给予普通颗粒饲料喂养；②高脂饮食组12只：给予高脂饮食喂养12周（胆固醇+猪油+蛋黄+普通颗粒饲料）建立兔As模型；③氟伐他汀组12只：给予高脂饮食同时+氟伐他汀10mg/kg/d喂养12周；（2）留取兔主动脉，HE染色光镜观察As斑块形成和血管外膜炎症浸润；（3）用自动血生化分析仪进行血脂分析；（4）免疫组织化学检测外膜成纤维细胞NF-κB活性及α-肌动蛋白（α-Smooth muscle actin，α-SMactin）的表达；（5）分析血脂指标分别与血管外膜炎症细胞数、外膜成纤维细胞NF-κBp65活性及α-SMactin表达的关系；外膜炎症细胞浸润与As斑块面积的关系；成纤维细胞NF-κBp65活性与α-SMactin表达的关系。结果：（1）高脂饮食组及氟伐他汀组总胆固醇（Total cholesterol，TC）及低密度脂蛋白（low-dentity lipoprotein，LDL）较正常对照组均明显增高（P＜0.01），但氟伐他汀组与高脂饮食组比较明显降低（P＜0.01）；（2）高脂饮食组及氟伐他汀组动脉内膜均较正常对照组明显增厚（P＜0.01），有明显粥样斑块形成，但氟伐他汀组与高脂饮食组比较，内膜厚度及斑块面积明显减少（P＜0.01）；（3）正常对照组血管外膜几乎无炎症细胞浸润，血管外膜成纤维细胞也几乎无α-SMactin表达及NF-κBp65活性；高脂饮食组及氟伐他汀组血管外膜均有明显炎症细胞浸润，成纤维细胞NF-κBp65活性及α-SMactin表达增加，但氟伐他汀组较高脂饮食组外膜炎症细胞浸润、成纤维细胞NF-κBp65活性及α-SMactin的表达均明显减少（P＜0.05）；（4）高脂饮食组及氟伐他汀组TC及LDL与主动脉外膜炎症细胞数、NF-κBp65活性及α-SMactin表达均呈正相关，以LDL相关性较好（高脂组LDL与外膜炎症细胞数及NF-κBp65活性的相关系数均为r=0.683，P＜0.05，LDL与α-SMactin表达的相关系数为r=0.708，P＜0.05；他汀组LDL与外膜炎症细胞数及NF-κBp65活性的相关系数分别为r=0.775，P＜0.01，r=0.726，P＜0.05；LDL与α-SMactin表达的相关系数为r=0.769，P＜0.01；），HDL与外膜炎症细胞数、NF-κB活性及α-SMactin表达呈负相关；TG无明显相关性（P＞0.05）；（5）高脂饮食组和氟伐他汀组外膜成纤维细胞NF-κBp65活性与α-SMactin的表达呈显著正相关（相关系数分别为r=0.633及0.649，P＜0.05），外膜炎症细胞浸润与斑块面积呈正相关（相关系数分别为r=0.648及0.663，P＜0.05）。结论：（1）实验性高脂饮食建立As模型成功，高脂饮食可以引起血脂明显异常。（2）HC尤其是LDL升高与As血管外膜炎症、外膜成纤维细胞表型转化及NF-κBp65的活性有关；（3）血管外膜炎症细胞浸润与As病变程度呈正相关；（4）外膜成纤维细胞NF-κBp65的活性与其表型转化呈正相关；（5）氟伐他汀能抑制As血管外膜炎症细胞浸润及外膜成纤维细胞表型转化和NF-κB的活性。论文Ⅱ氧化低密度脂蛋白对成纤维细胞表型转化、增殖及炎症因子合成的影响背景：成纤维细胞是血管外膜的主要细胞成分，在正常状态下，血管外膜成纤维细胞（Adventitial fibroblasts，AF）处于相对“静止”状态，但某些病理状态下，“静止”的AF可以转化为肌成纤维细胞（Myofibroblasts，MF），MF是具有平滑肌细胞特点的成纤维细胞，能分泌多种细胞因子和炎症介质，参入免疫和炎症反应。我们在动物实验中发现：As的血管外膜成纤维细胞被激活、转化为MF，且AF的转化与HC尤其是LDL升高呈正相关，但LDL能否引起成纤维细胞表型转化、增殖及炎症因子合成目前国内外鲜见报道，为此，我们应用氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）直接作用于培养的成纤维细胞，观察ox-LDL对成纤维细胞的表型转化、增殖及炎症因子合成的影响。目的：用含有ox-LDL的培养基孵育人胚肺成纤维细胞（HEFs），并用IκB-α磷酸化抑制剂BAY11-7082进行干预，观察成纤维细胞的表型变化、增殖及炎症因子合成的变化，以探讨ox-LDL对成纤维细胞的影响及其机制。方法：（1）HEFs传代培养，并用特异性抗原波形蛋白（Vimentin）及α-SMactin进行免疫细胞化学特性鉴定，取3-8代进行实验。分为：①正常对照组：培养基中不加刺激物；②ox-LDL1组：培养基中加入25μg/ml的ox-LDL；③ox-LDL2组：培养基中加入50μg/ml的ox-LDL；④ox-LDL3组：培养基中加入100μg/ml的ox-LDL；⑤BAY11-7082组：培养基中先加入10μg/ml的BAY11-7082将HEFs孵育1h，再加入100μg/ml的ox-LDL。将各组HEFs培养24h；（2）MTT比色试验检测细胞增殖；（3）用流式细胞技术检测细胞增殖周期；（4）免疫细胞化学法检测α-SMactin、转化生长因子β₁（Transforming growth factorβ₁，TGF-β₁）、单核细胞趋化蛋白-1（Monocyte chemoattractant protein，MCP-1）的表达和NF-КBp65的活性；（5）原位杂交检测NF-κBp65mRNA、TGF-β₁-mRNA及MCP-1mRNA的表达；（6）ELISA检测各组细胞培养液中IL-1α、IL-6的含量；（7）分别分析不同浓度的ox-LDL对HEFs的细胞活性、细胞周期、NF-КBp65的活性、α-SMactin、TGF-β₁和MCP-1表达以及IL-1α、IL-6合成的影响。结果：1、细胞特性鉴定显示：培养的细胞特异性Vimentin抗原染色阳性，α-SMactin阴性；2、MTT比色显示：50μg/ml及100μg/ml的ox-LDL组细胞增殖率均较正常对照组明显增强，差异有显著性（P＜0.05），BAY11-7082组细胞增殖率较正常对照组比较无显著性差异（P＞0.05）；3、流式细胞仪检测显示：不同浓度的ox-LDL均能使进入G₁期或S期的细胞增加，以100μg/ml ox-LDL组进入S期的成纤维细胞最多，与正常组比较有显著性差异（P＜0.05），BAY11-7082组细胞周期与正常对照组比较无显著性差异（P＞0.05）；4、正常对照组和BAY11-7082组HEFs几乎无NF-КBp65的活性及α-SMactin表达，TGF-β₁的表达微弱，原位杂交检测显示：正常对照组几乎无NF-КBp65mRNA表达，而BAY11-7082组NF-КBp65mRNA表达明显，两组细胞TGF-β₁mRNA表达微弱；ox-LDL各组均有α-SMactin、TGF-β₁表达及NF-КBp65的活性，与原位杂交检测显示的NF-КBp65mRNA及TGF-β₁mRNA表达增加一致，且呈浓度依赖性，各组间有显著性差异（P＜0.05）；5、正常对照组和BAY11-7082组无MCP-1及MCP-1mRNA的表达，也无IL-1α、IL-6的分泌；ox-LDL各组均能刺激HEFs表达MCP-1及MCP-1mRNA并分泌IL-1α、IL-6，且呈浓度依赖性，各组间差异具有显著性（P＜0.05）。IL-1α、IL-6的含量均与MCP-1的表达呈显著正相关，相关系数分别为r=0.932，0.834（P＜0.01）。结论：（1）ox-LDL能诱导成纤维细胞表型转化，且呈浓度依赖性：（2）不同浓度的ox-LDL均能影响成纤维细胞的细胞周期，使细胞的增殖增加；（3）ox-LDL能浓度依赖性的诱导成纤维细胞表达炎症因子MCP-1及IL-1α、IL-6；（4）ox-LDL诱导成纤维细胞合成IL-1α、IL-6可能与MCP-1的表达增加有关；（5）ox-LDL可能通过NF-κB通路诱导成纤维细胞的表型转化、增殖和炎症因子的合成。氟伐他汀对氧化低密度脂蛋白诱导的成纤维细胞迁移及炎症因子合成的干预作用背景：大量临床实验已证实3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂（3-Hydroxy-3-methyglutary coenzyme A reductase inhibitors，HMCI）能明显减少冠心病的临床事件，其降脂作用已众所周知，而其非降脂作用尤其是抗炎作用是近几年的研究热点，但大多数研究主要是针对HMCI对血管内膜炎症的影响，有关HMCI对As血管外膜影响的研究目前国内外报道较少。我们在前期动物实验中观察到HMCI类药物-氟伐他汀能明显抑制As的血管外膜炎症细胞浸润及外膜成纤维细胞的表型转化和NF-κBp65的活性，说明氟伐他汀具有抗As血管外膜炎症、抑制成纤维细胞的表型转化，改善血管重塑的作用，但这种作用是否独立于降脂作用之外尚不清楚，为此，我们在HEFs的培养基中直接加入不同浓度的氟伐他汀及ox-LDL，观察对HEFs的迁移和炎症因子合成的影响。目的：将HEFs在含有氟伐他汀及ox-LDL的培养基中孵育，观察成纤维细胞的迁移及炎症因子合成的变化，以探讨氟伐他汀对ox-LDL诱导的成纤维细胞变化的抑制作用。方法：（1）人胚肺成纤维细胞（HEFs）传代培养，并用波形蛋白（Vimentin）及a-SMactin免疫细胞化学进行特性鉴定，取3-8代进行实验。分为：①正常对照组：培养基中不加刺激物；②ox-LDL组：培养基中加入100μg／ml的ox-LDL；③他汀1组：培养基中先加入1×10^-7mol／L的氟伐他汀孵育HEFs 4h，再加入100μg／ml的ox-LDL；④他汀2组：培养基中先加入1×10^-6mol／L的氟伐他汀孵育HEFs 4h，再加入100μg／ml的ox-LDL；⑤他汀3组：培养基中先加入1×10^-5mol／L的氟伐他汀孵育HEFs 4h，再加入100μg／ml的ox-LDL；将各组HEFs培养24h；（2）应用Sarkar等的方法测定细胞迁移距离；（3）免疫细胞化学法检测MCP-1的表达；（4）ELISA检测各组细胞培养液中IL-1α、IL-6的含量；（5）分析MCP-1表达与IL-1α、IL-6合成的相关性。结果：（1）细胞特性鉴定同第二部分；（2）各浓度的氟伐他汀对ox-LDL诱导的成纤维细胞迁移均有抑制作用，且呈浓度依赖性，各组间有显著性差异，（F=23.947，P＜0.01）；（3）氟伐他汀组可剂量依赖性抑制ox-LDL诱导的HEFs的MCP-1表达和IL-1α、IL-6的合成，但各组仍较正常对照组增加，差异有显著性（P＜0.05）；（4）IL-1α、IL-6的合成均与MCP-1的表达呈显著正相关（相关系数分别为r=0.947，P＜0.01及0.757，P＜0.05）结论：（1）氟伐他汀在降脂作用外能剂量依赖性的抑制ox-LDL诱导的成纤维细胞的迁移；（2）氟伐他汀降脂作用外能剂量依赖性抑制ox-LDL诱导的成纤维细胞MCP-1的表达及IL-1α和IL-6的合成；（3）氟伐他汀对ox-LDL诱导的成纤维细胞IL-1α和IL-6合成的抑制作用可能与抑制MCP-1的表达相关。