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第一部分体外抗HBV细胞模型建立及细胞上清液HBVDNA、HBV RNA、HBsAg与肝细胞内cccDNA动力学关系研究目的:肝细胞内共价闭合环状DNA（cccDNA）的存在和活跃转录是乙型肝炎病毒（HBV）持续感染和慢乙肝（CHB）难以治愈的根源。HBVDNA、HBVRNA和乙肝表面抗原（HBsAg）均为肝细胞内cccDNA转录的血清表达产物。目前的HBV相关细胞模型研究多为短时间研究。本部分拟构建体外长期抗HBV细胞模型,探索HBV DNA、HBV RNA、HBsAg与肝细胞内cccDNA的动力学关系,阐明抗HBV过程中HBV DNA、HBV RNA、HBsAg与cccDNA的相关性。方法:（1）通过CCK-8法细胞增殖毒性实验探索替诺福韦酯（TDF）和干扰素（IFN）抗HBV细胞模型的体外最适给药浓度;（2）选取HepG2细胞作为空白对照组,HepG2.2.15细胞分为阴性对照组、TDF干预实验组、IFN干预实验组,体外构建抗HBV细胞模型进行长期培养,TDF干预组在检测到HBV DNA低于检测下限时,分为TDF干预组和TDF联合IFN组继续培养;（3）每3天传代并收集细胞和细胞上清液,提取细胞内总DNA（tDNA）,经PSAD酶消化后通过实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）检测cccDNA载量;提取细胞上清tDNA,应用逆转录PCR和荧光定量PCR法检测HBV DNA和HBV RNA载量;酶联免疫吸附试验（ELISA）检测HBsAg水平;（4）运用重复测量方差分析分别比较同一抗HBV细胞模型不同时间点cccDNA、HBVDNA、HBVRNA载量和HBsAg水平差异及不同抗HBV细胞模型不同时间点同一指标的水平差异;双变量直线皮尔森（Pearson）相关分析方法分析各细胞上清指标与肝细胞cccDNA的相关性。结果:（1）CCK8细胞增殖毒性试验显示细胞抑制率≤10%时TDF最佳给药浓度为12uM,IFN为100 ng/ml;（2）连续培养24周,阴性对照组各时间点细胞数和生物学指标稳定。TDF和IFN干预组细胞数和生物学指标从基线至20周稳定,培养24周细胞数开始明显下降（与基线比较,P＜0.05）;TDF联合IFN干预组培养第20周细胞数开始明显下降（与基线比较,P＜0.05）,第24周终止实验;（3）TDF干预组:cccDNA载量第16、20、24周显著低于基线（P＜0.05）,但24周仍在检测上限;HBVDNA载量给药第4、8、12、16、20、24周显著低于基线（P＜0.05）,第12周起低于检测下限;HBVRNA载量第12、16、20、24周显著低于基线（P＜0.05）,第24周低于检测下限;HBsAg水平第12、16、20、24周显著低于基线（P＜0.05）,但24周仍在检测上限;（3）IFN干预组:cccDNA载量第16、20、24周显著低于基线（P＜0.05）,但24周仍在检测上限;HBVDNA载量第8、12、16、20、24周显著低于基线（P＜0.05）,第20周起低于检测下限;HBVRNA载量第12、16、20、24周显著低于基线（P＜0.05）,第24周起低于检测下限;HBsAg水平第8、12、16、20、24周显著低于基线（P＜0.05）,但24周仍在检测上限;（4）TDF联合IFN干预组:TDF干预组在第12周HBV DNA低于检测下限后分为TDF单独干预组和TDF联合IFN干预组。联合干预组cccDNA载量第16、20、24周显著低于基线（P＜0.05）,但24周仍在检测上限;HBVRNA载量第12、16、20、24周显著低于基线（P＜0.05）,第20周低于检测下限;HBsAg水平第8、12、16、20、24周显著低于基线（P＜0.05）,但24周仍在检测上限;（5）从基线至24周,cccDNA下降幅度:联合组＞IFN组＞TDF组;HBV DNA阴转速度:TDF组＞IFN组;HBVRNA 下降幅度:联合组＞TDF组＞IFN组;HBsAg下降速度:联合组＞IFN组＞TDF组;（6）用药基线细胞上清HBVDNA、HBV RNA载量与HBsAg水平与cccDNA载量均存在高度正相关关系（r＞0.8,P＜0.05）;用药4周HBVRNA载量与cccDNA载量存在高度正相关（r=0.834,P=0.005）,HBsAg水平与cccDNA载量中度正相关（r=0.700,P=0.036）;用药8周HBVRNA载量与cccDNA载量中度正相关（r=0.701,P=0.009）,其余时间点均无明显相关。结论:（1）单一药物干预培养后,cccDNA、HBVDNA、HBVRNA和HBsAg均下降,HBVDNA下降最迅速,cccDNA 下降最缓慢,TDF组HBV RNA 下降快于IFN组,IFN组HBsAg下降快于TDF组;（2）HBVDNA低于检测下限后,TDF和IFN联合给药可提高体外抗HBV细胞模型的HBV RNA阴转速度和cccDNA、HBsAg下降幅度,但是细胞毒性较大。第二部分HBV RNA和HBsAg作为肝细胞cccDNA转录血清标记物和安全停药可靠指标的体内研究目的:肝细胞内共价闭合环状DNA（cccDNA）的持续存在和转录活跃是乙型肝炎病毒（HBV）持续感染和慢性乙型肝炎（CHB）患者核苷（酸）类似物（NAs）治疗停药复发的根本原因,但临床检测cccDNA受有创操作局限,难以临床广泛应用。HBVRNA和乙肝表面抗原（HBsAg）均为目前推荐的用于反映NAs抗病毒治疗后慢乙肝患者肝细胞内cccDNA载量和转录状态的血清标记物。本课题第一部分研究通过体外细胞模型阐明抗HBV过程中HBVRNA和HBsAg与肝细胞内cccDNA的动力学关系,但体外实验不能完全模拟体内情况,本部分拟通过本团队前期建立的停药队列体内深入探索血清HBVRNA和HBsAg水平与肝细胞内cccDNA载量及转录状态的关系,血清HBVRNA和HBsAg能否作为替代肝细胞内cccDNA载量及转录状态的血清标记物,并通过停药患者复发情况验证血清HBVRNA和HBsAg指导NAs治疗慢乙肝患者安全停药的可靠性。方法:本部分分为两小部分,第一部分为探索部分:选取NAs抗病毒治疗后行肝穿刺活检停药的慢乙肝患者,分别提取停药点肝组织和抗病毒治疗期间各随访点血清tDNA,通过实时荧光定量PCR法检测肝组织cccDNA和各随访点血清HBV DNA、HBV RNA载量,化学发光法定量检测各随访点血清HBsAg水平;分层分析肝组织cccDNA载量对停药结局的影响,计算cccDNA转录静默的cut-off值,通过ROC曲线计算停药点血清HBVRNA维持应答时长和HBsAg水平预测cccDNA静默状态的cut-off值,提出应用HBVRNA和HBsAg评估cccDNA载量及其安全停药建议。第二部分为验证部分:通过停药患者血清及复发情况,K-M法计算停药后的累计病毒学复发率,多因素Cox 比例风险回归模型分析影响停药复发的相关因素;根据停药复发情况验证2017版EASL指南推荐的停药标准和血清HBV RNA和HBsAg指导NAs治疗慢乙肝患者安全停药建议的可靠性。结果:（1）共88例停药时行肝穿患者的肝组织用于研究cccDNA转录状态,停药前平均用药疗程61.8±20.1月,停药后未复发患者平均随访70.8±43.1月;（2）预测停药复发各指标曲线下面积AUC:cccDNA＞HBsAg＞HBVRNA,分别为0.901、0.829和0.726;（3）停药5年以上未复发患者肝组织 cccDNA 载量最低,平均为0.65 copies/cell,cccDNA载量 0.65 copies/cell为静默状态的临界值;（4）停药点血清HBVRNA维持应答时长和HBsAg水平预测cccDNA静默状态的cut-off值分别为24个月和2.6 log10 IU/ml;（5）HBVRNA维持应答时长和HBsAg水平单独评估cccDNA静默状态的符合率分别为58.0%和66.7%,联合评估的符合率为75.4%;（6）134例停药患者血清用于验证HBVRNA和HBsAg指导安全停药的可靠性,停药前平均用药疗程48.6±20.6月,停药后未复发患者平均随访81.9±34.5月;（7）在观察终点,累计复发116例,未复发患者最长停药观察时长133个月,停药1年、5年、10年的累计病毒学复发率分别为67.2%、80.7%和91.3%;（8）多因素Cox模型分析显示停药点HBVRNA载量、HBsAg水平是影响停药复发的正性危险因素,HBVRNA维持应答时长是影响复发的负性危险因素;（9）2017版EASL指南停药标准指导停药,达标停药95例,不达标停药39例,停药验证总体符合率为38.1%;（10）HBVRNA维持应答时长和HBsAg水平指导停药建议的验证总体符合率高达90.3%;结论:（1）肝细胞内cccDNA载量是预测停药结局的最准确指标,cccDNA静默状态的载量界值为0.65 copies/cell;（2）血清HBV RNA维持应答时长与HBsAg水平可以预测肝细胞cccDNA载量和指导安全停药;第三部分慢乙肝患者NAs/IFN单用及联用治疗方案对血清HBV RNA和HBsAg水平影响的前瞻性队列研究目的:核苷（酸）类似物（NAs）和干扰素（IFN）是目前各大指南推荐的两大类抗乙型肝炎病毒（HBV）药物,但它们的抗HBV作用机制及优势侧重各不相同。不同的抗病毒方案选择的观察指标不同将影响疗效判断。本课题第一部分已通过抗HBV细胞模型体外证实TDF与IFN联合给药可提高HBVRNA阴转速度和HBsAg下降幅度,第二部分体内队列研究显示HBVRNA联合HBsAg可指导慢乙肝患者安全停药。本部分研究拟通过NAs经治的慢乙肝临床队列,动态检测血清HBVRNA和HBsAg水平变化,评估NAs单用和与IFN联合抗病毒治疗方案疗效。方法:（1）选取ETV/TDF抗病毒治疗3年以上,达到HBVDNA维持病毒学应答1年以上,血清HBsAg 阳性且＜3000 IU/ml的慢乙肝优势人群,随机分成两组,一组继续ETV/TDF单药治疗,一组NAs联合IFN治疗并随访至少72周;（2）每12周通过荧光定量聚合酶链式反应（PCR）法检测血清HBVRNA载量和HBsAg水平;（3）运用重复测量方差分析比较各随访点两组患者血清HBV RNA和HBsAg水平差异,log-rank检验比较两组患者血清HBV RNA和HBsAg累计阴转率差异。结果:（1）共纳入54例患者,其中27例入组后继续单用NAs治疗,27例入组后NAs联合IFN治疗;（2）在随访各点,NAs联合IFN组的血清HBsAg水平均显著低于单用NAs组（P＜0.05）,随访72周,NAs组没有患者（0/27）获得HBsAg阴转,NAs联合IFN组49.44%（13/27）患者获得HBsAg阴转,log-rank检验两组患者各随访点HBsAg累计阴转率均存在显著差异（P＜0.0001）;（3）在入组基线和随访12周,两组患者血清HBV RNA载量无明显差异（P＞0.05）,在随访24周、36周、48周、60周和72周,NAs联合IFN组血清HBV RNA载量均显著低于NAs组（P＜0.05）。在入组基线,两组均66%患者获得HBV RNA阴转,NAs联合IFN组用药36周,100%患者获得HBVRNA阴转,NAs组患者随访72周,HBVRNA阴转率为81.5%,log-rank检验两组患者各随访点HBVRNA累计阴转率均存在显著差异（P=0.000）;（4）NAs联合IFN组13例患者HBsAg阴转,停药后平均随访18.3±8.6个月,13例患者均未出现HBsAg、HBVRNA或HBVDNA 阳转。结论:（1）HBV RNA与HBsAg是评估抗病毒疗效的可靠可行的血清学指标;（2）NAs经治的慢乙肝优势人群,NAs联合IFN治疗可显著提高HBVRNA和HBsAg阴转率,尽早实现临床功能性治愈。