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目的:鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma,NPC)是一种发病极具地域和人群特色的恶性疾病,主要高发于中国南方、东南亚和非洲北部等地区,中国广东省的发病率居世界首位.目前尚不清楚鼻咽癌的发病机制,多数研究认为鼻咽癌的发生是遗传因素、EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)和其它环境因素共同作用的结果.EB病毒作为一种特殊的环境致病因子,与鼻咽癌的发生发展密切相关:鼻咽癌患者血清中EB病毒特异性抗体IgA/VCA、IgA/EA和DNA酶抗体水平显著升高;EB病毒感染发生于鼻咽癌细胞的单克隆增殖之前;EB病毒DNA及其表达产物在鼻咽癌病灶中的广泛检出等.2.研究方法与结果;2.1EB病毒A73和RPMS1基因在鼻咽癌组织和细胞株中的表达;目的:了解EB病毒A73和RPMS1基因在广东地区鼻咽癌组织和细胞株中的转录表达状况.方法:收集54例鼻咽癌和25例鼻咽非癌活检组织标本,16例鼻咽癌患者外周血淋巴细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)(取自54例鼻咽癌组织标本相对应的患者)和16例非鼻咽癌(其它肿瘤患者)外周血淋巴细胞标本;常规培养鼻咽癌细胞系SUNE1和淋巴细胞来源的B95-8、Raji和BJAB细胞系.通过巢式PCR扩增EB病毒W序列来检测各样品中EB病毒的感染情况,以半定量RT-PCR检测A73和RPMS1基因在各标本中的表达状况.结果:在全部鼻咽活检组织标本、87.5﹪(14/16)的鼻咽癌PBMCs、93.8﹪(15/16)的非鼻咽癌PBMCs和除阴性对照BJAB细胞外的其它全部细胞系中均检测到了EB病毒W片段,表明EB病毒感染十分广泛.2.2EB病毒A73和RPMS1基因的克隆及其编码序列分析;目的:对来自广东地区鼻咽癌的A73和RPMS1基因的编码序列进行克隆测序及序列分析,了解其变异情况.方法:以RT-PCR从7例鼻咽癌新鲜活检组织中扩增EB病毒A73和RPMS1的全长编码序列(CDS),并克隆入pGEM-T Easy载体,PCR和BamH I/HindⅢ双酶切鉴定,并以T7/SP6引物对其进行测序.结果:重组质粒pGEM-T Easy/A73和pGEM-T Easy/RPMS1经PCR和酶切鉴定均含目的基因片段.测序后经序列分析发现:A73 CDS的45nt出现一个高频变异位点(7/7),即其mRNA 1148 nt和DNA VB外显子157154 nt位点,由腺嘌呤变为胞嘧啶(a→c),但未引起相应氨基酸变化;RPMS1的CDS也出现一个高频变异位点(6/7),位于其151 nt,即其mRNA 654nt和DNA 155849nt位点,由鸟嘌呤变为腺嘌呤(g→a),引起相应第51位的天冬氨酸变为天冬酰氨(D→N).提示两基因可能与鼻咽癌发生相关.2.3EB病毒A73和RPMS1基因编码蛋白在HEK293细胞中的表达和定位;目的:明确EB病毒RPMS1和A73基因编码蛋白在HEK293上皮细胞中的表达及其表达的亚细胞区域.方法:采用定向克隆技术分别将A73和RPMS1基因亚克隆入绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP-C2,构建pEGFP-C2/A73和pEGFP-C2/RPMS1重组表达载体,PCR和酶切鉴定后,以脂质体技术将各重组质粒和空载体分别转入HEK293细胞.以RT-PCR检测各组转染细胞中目的基因的表达;使用激光扫描共聚焦显微镜观察其融合蛋白的表达,并确定其表达的亚细胞区域.结果:经鉴定A73和RPMS1基因插入正确,pEGFP-C2/A73和pEGFP-C2/RPMS1重组表达质粒构建成功.2.4EB病毒A73和RPMS1基因对HEK293细胞增殖特性的影响.目的:通过研究EB病毒A73和RPMS1基因对HEK293上皮细胞增殖特性的影响,明确两基因的生物学转化功能.方法:将A73和RPMS1定向亚克隆入pcDNA3.0,构建其重组表达载体.结果:重组表达质粒pcDNA3.0/A73和pcDNA3.0/RPMS1构建成功.瞬时转染和稳定转染细胞中均分别出现A73和RPMS1的表达.3.结论:3.1该研究首次对EB病毒A73和RPMS1基因在广东地区鼻咽癌组织中的表达进行研究,发现两基因在鼻咽癌组织广泛转录表达,在鼻咽癌非癌组织中表达很低,在鼻咽癌和非鼻咽癌外周血淋巴细胞中不表达,表明A73和RPMS1基因与鼻咽癌的发生发展密切相关.3.2与B59-8株相比,来自鼻咽癌EB病毒的A73和RPMS1基因的编码区各存在一个高频率的碱基替换,其中RPMS1的碱基改变引起了编码区氨基酸的变化,提示A73和RPMS1基因的编码序列存在变异,而且两变异可能与鼻咽癌的发生有关.3.3我们对A73和RPMS1基因编码蛋白在HEK293细胞中的动态表达进行了定位,结果显示A73主要表达于细胞浆,RPMS1则以细胞核为主,提示它们分别以胞核和胞浆为其功能区域,可能通过影响细胞的信号转导和转录调控过程而发挥功能.3.4首次对A73和RPMS1基因的生物学转化特性进行了研究,发现RPMS1基因在体外能够转化HEK293上皮细胞,在裸鼠体内可以成瘤,因此我们认为RPMS1基因具有在体内外转化上皮细胞的特性,可能参与鼻咽上皮癌变;而A73无明显转化HEK293细胞的作用,其生物学功能有待于进一步研究.