纳米生物复合材料修饰的免疫传感器对微囊藻毒素的灵敏检测

来源 :华南农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:hujun_xiao
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微囊藻毒素(Microcystins,MC)是水体中一种分布广泛的肝毒素,也是城市生活饮用水的常规检测项目之一。常规的检测手段是利用高效液相色谱等大型仪器,但是这种检测方法不仅仪器昂贵,而且样品前处理复杂,耗时长,分析成本较高,难以实现对环境的实时监测。因此,需要建立灵敏度高、简单快速的方法来检测水体中的微囊藻毒素。免疫传感器是近几十年来发展快速的分析检测技术之一,其建立在抗原和抗体之间的特异性反应的基础上,较其它生物传感器,有更高的专一性和选择性。同时可以结合各种光或电分析技术,大大提高了灵敏度,在许多领域中得到了广泛的应用,正朝着更加灵敏、专一、微型化和实用性方向发展。本论文以建立最毒的微囊藻毒素(MC-LR)的快速筛查分析方法为目标,以提高测定灵敏度为重点,构建了3个基于电化学或光学检测信号的免疫传感器,通过纳米增强技术、酶催化放大技术和DNA扩增技术,提高传感器的灵敏度,实现对MC-LR的痕量检测。本论文主要开展的工作和结果如下:(1)原位合成生物相容性核壳纳米材料修饰的电化学免疫传感器对MC-LR的灵敏检测:通过原位生长法合成三维绒毛状的硅酸钴包覆碳纳米管(CNT@Co Silicate)核壳纳米复合物作为传感器基底和纳米金-聚多巴胺包覆的四氧化三铁纳米球(Fe3O4@PDA-Au)作为标记物载体,构建电化学免疫传感器用于MC-LR的检测。由于所合成的绒毛状CNT@Co Silicate和Fe3O4@PDA-Au均具有良好的生物相容性和大的比表面积,可以使大量的抗原、二抗等免疫分子和HRP信号响应物固定到其表面,大大地提高了免疫传感器灵敏度。研制的免疫传感器具有对MC-LR有较宽的检测范围(0.005μg/L-50μg/L),其检测下限可达到0.005μg/L。(2)DNA酶功能化介孔二氧化硅的多重放大电化学免疫传感器对MC-LR的检测:以树枝状纳米金为基底材料,介孔二氧化硅-DNA杂交链复合材料为标记物构建多重放大策略的电化学免疫传感器用于MC-LR的检测。先在氧化铟锡(ITO)电极上电沉积一层比表面巨大的树枝状的纳米金来作为传感器基底来捕获抗原分子。再合成分散性好、孔道均匀分布的介孔二氧化硅纳米材料(SiO2@MSN),在其孔道里吸附大量的电化学活性物质亚甲基蓝(Methylene blue,MB),在其表面同时负载用于免疫反应的二抗和用于信号放大的DNA引物S0,通过加入富含鸟嘌呤的辅助DNA S1和S2进行常温的杂交链反应(HCR),加入氯化血红素后在SiO2@MSN表面上生成两侧带G-四链体/血红素DNA模拟酶(G-quadruplex/hemin DNA酶)的长链DNA,最后加MB嵌入双螺旋DNA结构的凹槽中。在孔道里和DNA双链中的电子中介体MB的辅助下,杂交链两侧大量的具有过氧化物酶活性的G-quadruplex/heminDNA酶能催化双氧水产生较强的电化学响应信号,实现对MC-LR的检测。通过引入纳米材料、酶催化技术和DNA扩增技术来实现免疫传感器的多重信号放大效果,提高检测灵敏度,检测下限达到了0.3 ng/L,远远低于WTO关于饮用水中MC-LR含量的检测标准(1μg/L)。(3)基于纳米生物双重模拟酶的免疫传感器对微囊藻毒素的可视化检测:通过合成纳米模拟酶和DNA模拟酶串联的纳米生物模拟酶来构建免疫传感器来实现对MC-LR的可视化检测。先合成比表面积大的薄片状硅酸镍包覆的二氧化硅纳米球(SiO2@Co Silicate)作为免疫传感器的基底来固定抗原。其次合成一种具有笼状结构的Cu(OH)2人工纳米模拟酶,再通过氨基化试剂在其表面负载二抗和DNA引物S0,通过加入富含鸟嘌呤的辅助DNA S1和S2进行杂交链反应,接着加入氯化血红素,可以在Cu(OH)2 SC上生成两侧带大量G-quadruplex/hemin DNA酶的长链DNA,和Cu(OH)2 SC串联成具有更多催化单元的纳米生物模拟酶,增强检测信号。通过催化2’-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)的显色反应,实现对MC-LR的可视化检测,为商品化的便携检测方式提供研究基础。
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