论文部分内容阅读
疥螨病为重要的人兽共患寄生虫病,每年全球约有3亿人受到疥螨病的影响,可以感染超过100种宿主,在发展中国家(尤其是贫困地区)人群的感染率与发病率更为明显,严重危害着人类和其他哺乳动物的健康。该病除影响经济动物生长发育外,还会降低畜产品(肉类、奶类以及皮革)的质量,疥螨病继发细菌感染时甚至可引起蜂窝织炎和急性肾小球炎等,严重时会导致动物的死亡,造成巨大得经济损失。目前尚无针对疥螨病的疫苗和准确的诊断方法,因此了解疥螨和宿主的免疫互作机制对有效诊断方法和疫苗的研究具有重要意义。1疥螨感染宿主后疥螨及宿主的转录组和microRNA差异表达分析在本研究中分别对离体疥螨和寄生疥螨,健康宿主皮肤和宿主感染疥螨后病变皮肤的转录组和microRNA进行测序研究以及转录组和microRNA分析,观察了疥螨和宿主在感染前后各自基因和microRNA的差异表达以及差异表达基因对应的信号通路。通过转录组和microRNA测序以及转录组和microRNA的差异表达分析发现:疥螨感染宿主后,疥螨新陈代谢、细胞内信号通路相关的基因下调表达,疥螨与细胞外排和内吞功能相关基因高表达;疥螨下调表达的microRNA所对应的上调表达的靶标基因富集到与糖酵解、蛋白质水解功能相关的信号通路上。宿主感染疥螨后,宿主与细胞因子生成、活化,免疫球蛋白、信号肽合成相关的基因高表达,与T细胞增殖分化、白细胞增殖分化相关的基因高表达;宿主下调表达的microRNA所对应的上调表达的靶标富集到细胞膜表面受体合成及信号转导,T细胞、白细胞和淋巴细胞活化调控,免疫系统调控相关的信号通路上。研究结果表明:宿主感染疥螨后其免疫功能增强,新陈代谢下降,microRNA在宿主的免疫反应中起着重要的调控作用;同时,疥螨感染宿主后,由于宿主的免疫反应作用,导致疥螨增殖和代谢相关的通路基因被抑制表达。2疥螨钙调蛋白的特性分析以及血清学诊断潜力的初步评价钙调蛋白(CaM)是一种重要的钙离子传感器,参与了多种关键的生理活动过程。本试验完成了疥螨钙调蛋白的克隆、原核表达和生物信息学分析。通过免疫印迹方法鉴定了重组钙调蛋白(rSsCaM),并且采用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)评价了rSsCaM的血清学诊断潜力。同时,采用与8-苯胺基萘-1-磺酸(ANS)结合的试验方法对rSsCaM的钙离子结合特性进行了鉴定。研究结果表明:编码SsCaM基因的ORF包含450个碱基,编码149个氨基酸并且为可溶性表达;多序列比对和序列同源性分析了SsCaM与其他物种CaM的相似性和遗传进化关系;ANS荧光试验鉴定了rSsCaM的钙离子结合特性,荧光免疫组化表明CaM广泛分布在疥螨体内;以该重组蛋白建立的ELISA方法,其敏感性为87.5%(28/32),但是特异性只有22.5%(9/40),表明rSsCaM不适合作为疥螨病的诊断抗原。3疥螨甘油醛三磷酸脱氢酶的生物信息学分析以及血清学诊断潜力初步评价甘油醛三磷酸脱氢酶(GAPDH)是糖酵解途径的经典代谢酶,在分子生物学研究中发挥着重要作用。本研究通过原核表达纯化得到疥螨重组甘油醛-3-磷酸脱氢酶(rSsGAPDH),对其进行了免疫印迹、生物信息学分析以及诊断潜力的探究。结果显示:编码SsGAPDH基因的ORF包含918个碱基,编码305个氨基酸,其分子量约为33.55 kDa,等电点为4.95,不含信号肽;该蛋白质能够被自然感染疥螨的兔阳性血清识别,具有较强的反应原性。以rSsGAPDH作为抗原的间接ELISA敏感性为81.3%(13/16),特异性为22.2%(8/36),表明rSsGAPDH不适合作为疥螨病的诊断抗原。4疥螨几丁质酶样蛋白的过敏原性鉴定和血清学诊断潜力初步评价几丁质酶样蛋白(CLP)属于糖苷水解酶家族,参与多种生物功能,包括炎症反应和感染等。本研究原核表达、纯化得到疥螨重组几丁质酶样蛋白(rSsCLP),对其进行了免疫印迹鉴定以及间接ELISA诊断方法的建立。编码SsCLP基因的ORF包含1275个碱基,编码424个氨基酸,其分子量约为47.6 kDa,等电点为9.16,不含信号肽。免疫印迹结果显示,该蛋白质能够被自然感染疥螨的兔阳性血清以及抗CLP高免兔血清识别,具有较强的反应原性。以rSsCLP作为诊断抗原的间接ELISA方法其敏感性为94.4%(17/18),特异性为86.7%(26/30),且rSsCLP对人工感染疥螨1周的兔血清阳性检出率为96.7%(29/30),表明rSsCLP对疥螨病具有早期诊断潜力,是一个很好的诊断抗原。同时,皮肤点刺试验显示宿主皮肤出现风团反应,表明rSsCLP可以引起宿主皮肤产生过敏反应。5疥螨丙糖磷酸异构酶的过敏原性鉴定和血清学诊断潜力评价丙糖磷酸异构酶(TIM)是催化丙糖磷酸甘油醛3-磷酸和磷酸二羟丙酮的可逆相互转化的酶,在本研究中通过克隆,原核表达和免疫印迹鉴定等方式深入了解疥螨的丙糖磷酸异构酶。编码SsTIM基因的ORF504个碱基,编码167个氨基酸,其分子量约为18.3 kDa,等电点为5.4,不含信号肽。多序列比对结果表明SsTIM氨基酸序列与粉尘螨和埋内欧尘螨的TIM分别具有89%和88%的同源性,系统进化分析表明疥螨TIM与粉尘螨和埋内欧尘螨的TIM在同一个分支上。免疫定位测定显示荧光信号定位于螨虫咀嚼的口器,腿和角化皮肤以及病变的兔皮肤和嵌入皮肤的螨虫中。rSsTIM的皮肤点刺试验出现风团反应,表明疥螨丙糖磷酸异构酶可以引起宿主皮肤产生过敏反应。