第一部分：局灶性脑缺血再灌致脑梗塞大鼠炎症反应及凋亡时程变化规律的研究 目的：炎症反应参与了缺血性脑损伤的病理生理变化并参与和促进了细胞凋亡的发生发展，但其具体的发生机理与病理过程尚不十分清楚，针对炎症反应的有效的治疗方法也很少。为进一步探讨炎症反应在ICVD中的发病机制，并为之后对山茱萸环烯醚萜苷药效学机理的研究奠定理论与实验基础，我们系统地观察了局灶性脑缺血2h后再灌注不同时间大鼠模型脑内的炎症反应、血液流变学与细胞凋亡等一系列相关指标的变化。 方法：采用了改良的插线法建立局灶性脑缺血大鼠模型，分别为假手术组，局灶缺血2h后再灌注6h、12h、24h、48h、72h与168h等不同时程的大鼠模型。各时程终点对大鼠进行神经功能评分；HE染色后光镜观察缺血损伤区形态学变化；腹主动脉取血测定高、中与低切变率下的全血粘度、红细胞聚集率与血浆纤维蛋白原含量的改变；OX-42与GFAP免疫组化法测定小胶质细胞活化与星形胶质细胞增生的变化；ELISA法与放免法测定IL-1β与TNF-α在患侧脑组织内含量的改变；免疫组化法测定Caspase-3的表达变化；Tunel法原位测定细胞凋亡的变化。各个实验的结果均使用Mean±SE表示，全部统计分析采用SPSS11.0软件，分别使用适合的统计学方法分析。 结果：局灶性脑缺血2h后再灌注不同时点的各组大鼠模型在神经功能损伤，病理形态学的变化，血液流变学改变，细胞凋亡及Caspase-3蛋白的表达以及各项炎症反应相关指标方面出现了多种有规律的时程变化，包括：1.神经功能损伤的出现。再灌注6h～72h之间均可以明显的观察到健侧前肢内受内旋、肌力下降、偏向转圈行走等典型的偏瘫症状。 2.缺血损伤区细胞数量的减少。光镜观察发现缺血后患侧损伤区细胞数量大量减少，这一趋势在再灌注后24h～48h最为明显。 3.各种血液流变学指标的升高。再灌注后12h全血粘度即开始升高，24h～72h最明显，之后逐渐恢复。与全血粘度密切相关的两个因素——红细胞聚集率与纤维蛋白原含量均发生改变，前者更为明显。 4.胶质细胞的活化与增生。小胶质细胞再灌注后活化明显，24h活化的小胶质细胞数量最多，以后也维持在较高水平；星形胶质细胞的增生与之相似，再灌注48h增生最多，之后略为改善。 5.炎性细胞因子的增多。缺血/再灌注后炎性细胞因子IL-1β与TNF-α含量显著增多，并分别在缺血后12h与48h达到峰值。 6.细胞凋亡及Caspase-3的表达增多。Caspase-3的表达在缺血后很快升高，再灌注后12h～48h最为显著；与之对应，细胞凋亡12h～72h较明显，并在24h～48h最多。 结论：局灶性脑缺血后再灌注不同时间可以出现多种病理生理学改变，包括炎症反应、血液流变学改变、凋亡出现、梗塞灶的形成以及神经功能损伤等，以上指标的改变从不同方面反映了缺血后神经元损伤的严重程度，并证明炎症反应与神经元迟发性损伤有密切的内在联系。由于这些病理变化多集中于再灌注24h左右，因此这一时点的局灶性脑缺血/再灌注模型可以很好的用来进行缺血性脑血管病的药物干预研究。 第二部分：山茱萸环烯醚萜苷抗脑缺血机理的研究 目的：阻止迟发性神经元损伤的发生发展是减轻缺血性脑损伤，改善预后的重要手段，炎症反应是造成迟发性神经元损伤的主要原因之一，炎性细胞因子与免疫细胞的激活在缺血再灌注损伤中的关键作用已得到证实。因此早期阻断或抑制炎症反应是改善缺血后脑损伤的较理想策略。为进一步探讨山茱萸有效部位环烯醚萜苷(CIG)防治ICVD的药理机制，我们对CIG进行了抗脑缺血的药效学研究，并观察了CIG对局灶性脑缺血/再灌注后炎症反应与细胞凋亡的抑制作用。 方法：1.采用拟缺血损伤的神经细胞模型，通过MTT法，LDH释放率，细胞内钙含量以及细胞凋亡的测定观察CIG对神经细胞的保护作用。2.观察CIG对大鼠脑血流量与双颈总动脉结扎小鼠存活时间的影响，初步评价CIG的抗脑缺血作用。3.光化学法制备脑梗塞大鼠模型，观察CIG对NO，NOS与NF-KB的影响。4.线栓法建立局灶性脑缺血2h后再灌注24h的假手术组、模型组、CIG20、60、180mg·kg-1与Nimodipine14mg·kg-1干预组大鼠模型，分别进行神经功能评分、梗塞体积的评定；HE染色与尼氏染色后观察缺血区病理变化；ELISA法测定IL-1β与TNF-α的改变；免疫组化OX-42与GFAP染色测定小胶质细胞活化与星形胶质细胞增生的变化；免疫组化与免疫印迹测定凋亡调控因子表达的变化；Tunel法与PI单染法测定神经元存活与凋亡的改变。实验结果采用Mean±SE表示，全部统计分析采用SPSS11.0软件，分别使用适合的统计学方法分析。 结果：各种实验证实CIG以下的作用： 1.在离体实验中，CIG可以减轻拟缺血刺激对细胞的损伤，保护线粒体，降低LDH释放率，减少凋亡细胞数量，这些作用与其抑制钙超载有关。2.胃肠道给药后发现CIG可以显著提高大鼠的脑血流量，并延长双颈总动脉结扎小鼠的存活时间。 3.在光化学法致脑梗塞模型上，CIG可以抑制大鼠患侧脑NOS活化，继而减少NO生成的增多和与NF-KB的活化。 4.在线栓法制备的局灶性脑缺血/再灌注大鼠模型上，CIG可以减轻神经功能损伤，减少患侧梗塞灶的面积。HE与尼氏染色后在光镜下观察发现CIG可以保护缺血区神经元，减少神经元损失。 6.CIG能抑制缺血区小胶质细胞的活化和星形胶质细胞的增生，继而抑制缺血后患侧脑组织IL-1β和TNF-α含量的增加。 7.CIG能调节缺血后脑组织内凋亡调控因子Bax、Bcl-2、Caspase-3与Fas的表达，并抑制缺血后神经元胞浆中细胞色素c增多，避免凋亡信号的激活。Tunel法与流式细胞术检测均证实CIG可以减少发生在脑缺血/再灌注后的细胞凋亡。 结论：本部分药效学的前期工作证明传统中药山茱萸有效部位CIG可以通过增加脑血流、减少钙超载与抑制NO生成等机制发挥确切的神经保护作用；CIG还可以抑制缺血后的炎症反应，并通过对各种凋亡调控因子的调节作用减少了细胞凋亡。研究结果提示CIG在防治缺血性脑血管病方面有良好的应用前景和开发价值。