骨质疏松症和椎间盘退行性变化均为中老年人常见病、多发病,往往可见于同一患者,严重影响其生活质量。研究表明骨质疏松患者易合并腰椎间盘退变,尤其是绝经后妇女骨质疏松症状越严重,其椎间盘退变程度也越重。这说明二者之间存在一定的内在联系或相似的发病机制,但国内外学者在雌激素、椎间盘营养、炎性因子、基因等方面的研究对其相关性得到了截然不同的结论。本研究试图在雌性山羊身上通过去势建立骨质疏松模型和椎间盘穿刺建立退变模型,并以复合模型研究二者的病理进程及推断其相关性,同时对骨质疏松山羊的骨髓间充质干细胞在椎间盘退变中可能存在的阻逆作用进行研究,为这两类疾病防治的临床与基础研究提供实验依据和新的思路。目的：构建山羊骨质疏松动物模型和椎间盘退变模型并对其进行系统全面的评价,以及探讨去势山羊骨质疏松与椎间盘退变二者的内在联系；对山羊BMSCs进行体外分离培养及生物学特性研究,并探讨骨质疏松山羊BMSCs是否存在阻逆椎间盘退变的作用。方法：18只3岁雌性山羊随机分为ABC3组,A组：假手术组,B组：行双侧卵巢切除术组(OVX Ⅰ组),C组：卵巢切除+甲强龙肌注组(OVX Ⅱ组),采用骨密度测量、Micro-CT扫描重建分析、血清钙磷及碱性磷酸酶(ALP)和骨钙素(BGP)检查及组织形态学观察、力学测试等方法评价山羊骨质疏松情况；将20只山羊随机分成A组：以16G针刺入8只山羊L3/4椎间盘并注入生理盐水0.1ml(实验组或造模组), B组：仅暴露8只羊的L3椎体下缘(sham组),C组(正常对照组)4只。对术前及术后1、3、6个月影像学资料、组织学及Ⅰ、Ⅱ型胶原免疫组化等结果进行统计学分析；采用健康雌性成年山羊24只,随机分为A组：正常对照组,B：单纯去势组,C：单纯穿刺组,D：复合组(卵巢切除+椎间盘穿刺),对腰椎MRI、X线、骨密度、病理组织学及免疫组化等结果进行统计学分析；抽取山羊骨髓进行BMSCs分离培养,并进行生长曲线描绘、表面标记物及细胞周期检测、成骨细胞及成软骨细胞诱导分化；选用成年山羊15只,随机分为A组：对照组3只和B组：实验组12只,对照组共显露山羊L2/3、L3/4,L4/5、L5/6四个椎间盘,实验组每只山羊显露L2/3、L3/4,L4/5共计36个椎间盘的同时行椎间盘穿刺+髓核抽吸,穿刺椎间盘随机纳入3组,其中B1组：单纯造模组、B2组：单纯海藻酸钠凝胶移植组、B3组：骨髓间充质干细胞+藻酸盐凝胶复合移植组,术后进行MRI扫描、DR检查及病理组织学、免疫组化染色观察分析。结果：构建骨质疏松模型各检测结果显示：1.骨密度检测： C组术后6个月腰椎BMD.BMC较术前有统计学差异(分别为t-=7.756,P<0.001和t=5.194,P0.003),分别下降26.91%和22.95%；并且与A组和B组相比均有显著性降低(P<0.05),均值低于A、B两组；B组术后6、12个月的腰椎BMD.BMC均较术前和假手术组(Sham组)有显著性降低(P<0.05),分别下降了11.96%、18.09%和29.30%、25.50%；Sham组手术前后BMD.BMC的变化无显著性差异(P>0.05)。2.Micro-CT检测：Tb.N、Tb.Sp、TBPf、BV/TV、BS/BV、SMI整体比较有统计学差异(P<0.001)；OVX Ⅰ组、Ⅱ组的Tb.N、Tb.Sp、TBPf、BV/TV、BS/BV、SMI与Sham组比较,均有统计学差异(P<0.05),而Tb.Th.DA无显著差异(P>0.05)。OVX Ⅰ、Ⅱ两组间差异无统计学意义(P>0.05)。B组12个月及c组术后6个月的腰椎骨小梁较Sham组明显稀疏,骨小梁变细、发生断裂,孔隙率增加,局部有较大的空隙形成,皮质骨变薄。3.血清学检查：Ⅰ、Ⅱ组Ca、P、ALP、BGP含量较sham组各时间点差异有统计学意义(P<0.05),呈上升趋势,分别较术前增加(45.07%、40.79%、41.19%和210.01%)、(45.16%、39.32%、39.12%和194.66%),假手术组各指标术前、术后无显著差异(P>0.05)。术后6个月BC组间差异有统计学意义(P<0.05),C组高于B组；手术组自身前后对照亦有统计学意义(P<0.05)。4.腰椎组织学观察：术前各组骨小梁形态规则、数量众多、排列整齐、粗细均匀、间隙小而连接成拱形结构,很少有小梁断裂。术后去势组较术前及假手术组的骨小梁数目减少、变薄变细、甚至断裂穿孔、髓腔扩大,局部可见骨缺损。5.力学测试表明,术后三组最大扩张压力整体差异有统计学意义(F=105.727,P<0.001)；假手术组椎体和去势组两两比较差异有统计学意义(P<0.05),且B、C组之间亦显著差异(P<0.05)。构建椎间盘退变模型结果显示：1.DR片：术后1个月A组即出现椎间隙变窄,并逐渐下降。术后1、3、6个月A、B、C各组椎间盘高度变化(%DHI)分别为85.45±2.48、68.90±4.07、56.77±4.43,94.37±2.42、94.50±1.85、93.87±2.64和95.89±2.60、94.82±1.98、95.13±2.81.对照组各时点差异无统计学意义(F=0.229,P=0.802),实验组与对照组各时点差异均有统计学意义(P<0.05)。2.MRI检查：两对照组L3/4椎间盘T2加权像始终呈高强度信号,髓核组织区域信号均匀、明亮,髓核与纤维环分界明显,椎间盘高度前后一致,即假手术组未发生椎间盘退变；而A组L3/4椎间盘髓核T2加权像信号强度逐渐降低,术后1个月椎间盘呈灰色、术后3个月呈灰黑色、术后6个月呈黑色,椎间隙逐渐狭窄。L3/4椎间盘髓核矢状位MRI T2W1信号值(灰度值)比较提示A组术前术后信号改变差异有统计学意义(P<0.05),且造模时间越长信号强度降低越明显。A组与对照组术后各时间点灰度值相比均有统计学意义(P<0.05)。3.组织学评价：肉眼观正常对照组椎间盘髓核呈白色胶冻状、含水丰富清亮饱满,纤维环结构清晰呈同心圆排列整齐；穿刺造模组椎间盘厚度有所下降,髓核颜色变灰暗、量少,纤维环结构粗糙。HE染色见正常椎间盘纤维环层次分明,与髓核界线清楚,髓核内有丰富的空泡细胞和小的类软骨样细胞,胶原蛋白排列成规则的网格状结构；退变椎间盘纤维环排列紊乱甚至断裂,髓核缩小,细胞数量减少,髓核内网格样结构消失,水分减少,髓核和纤维环界线不清。4.Ⅱ型胶原免疫组化检测：对照组以中央髓核组织染色为主,细胞外基质呈强阳性棕黄色染色；造模组术后1个月见淡黄染,且染色逐渐变淡,术后6个月基本无阳性表达。术后3个月A、B组灰度值分别为178.87±4.44、159.07+4.77；术后6个月ABC组分别为217.84±10.33、160.76±7.58、163.34±5.90。术后各时间点A与B、C组之间髓核平均灰度值均有统计学差异(P<0.05),A组术前术后自身对比均有统计学差异(P<0.05),对照各时点无统计学差异(P>0.05)。5.Ⅰ型胶原免疫组化检测：BC组纤维环外层Ⅰ型胶原呈强阳性染色,纤维环内层染色较弱,髓核中无染色,A组Ⅰ型胶原在纤维环内层及髓核阳性染色呈逐渐增强趋势。术后各时点A组与BC组之间平均灰度值有统计学差异(P<0.05),A组自身前后对照有统计学差异(P<0.05),对照组之间无统计学差异(P>0.05)。而二者相关实验结果提示：1.腰椎MRI:B组与A组术前及术后3、6个月之间无统计学意义,P>0.05；B组12月时、C组与D组术后3、6、12个月的L3/4椎间盘较A组均有退行性变化发生,P<0.05；其中D组术后6、12个月与其他组相比,椎间盘退变有统计学意义,P<0.05；术后3、6、12个月,CD组椎间盘T2WI信号值与B组比较有统计学意义,P<0.05；D组、C组自身对比,各时点信号值之间均有统计学意义,P<0.05；而B组,术后12个月T2WI信号值与术后3、6个月之间有统计学意义,P<0.05。2.腰椎X线：CD组术后3月椎间隙开始变窄并逐渐下降。术后3、6、12月C组、D组与其它组及自身前后%DHI对比,均有统计学意义,P<0.05；D组术后6、12个月与C组比较,椎间盘高度变化%DHI有统计学意义,P<0.05；B组术前及术后3、6个月时与A组间无意义,P>0.05,12月时与A组比较有统计学意义P<0.05。正常对照组0-12个月之间%DHI无统计意义P>0.05。3.骨密度检查：术后6、12个月,B组及D组BMD较术前显著性降低(P<0.05),与AC组相比均有显著性降低(P<0.05),但两组之间无显著性差异(P>0.05)；C组BMD较术前及A组无显著性降低(P>0.05)；A组之间无统计学差异(P>0.05)。4.椎体病理组织学HE染色：去势前、A组、C组的骨小梁形态较规则,排列整齐,粗细均匀,间隙较小。而BD组骨小梁数目减少、变薄变细、断裂穿孔、髓腔扩大,甚至有出血及骨缺损。5.椎间盘病理组织学HE染色：A组纤维环板层结构清晰,纤维排列整齐,髓核陷窝样结构饱满丰富,细胞数目多,髓核细胞核深染胞浆淡染；CD组纤维环板层分界模糊,纤维排列不规整,髓核陷窝样结构欠规则、减少或变小,细胞减少,基质密度低染色浅；D组极少髓核细胞,髓核缩小纤维化,退变程度重于C组。而B组有少许板层结构破坏、髓核细胞数量减少。6.Ⅱ型胶原免疫组化：AB组以中央髓核组织染色为主,细胞外基质染成棕黄色；C组淡黄染,D组基本无阳性表达。各组之间Ⅱ型胶原平均灰度值有统计学差异(P<0.05)。干细胞体外分离培养结果：1.原代细胞贴壁生长,呈短梭状或伴多个突起,核大,核仁清晰,多分裂相,逐渐转为形态均一、放射状排列。传代后多呈长梭形,增殖速度明显加快,融合成片状。2.生长曲线：P3生长曲线呈S形,第1-3天为相对滞缓期,第4-9为对数生长期,以后逐渐进入生长平台期。成骨及成软骨诱导细胞生长曲线类似。3.表面抗原标志物检测显示：CD29(76.8%)、CD44(93.6%)阳性表达,不表达CD34(4.3%)、CD45(5.9%)。4.第三代BMSCs细胞周期检测显示：G1期细胞为68.33%,G2期细胞为21.42%,S期细胞为10.25%,即大部分细胞处于静止期。5.碱性磷酸酶染色：成骨诱导2-3周ALP染色,多数细胞胞浆呈均匀浅灰色,胞质中有棕黑色阳性颗粒,细胞界限清楚,表现为ALP染色阳性。6.茜素红染色：细胞基质中出现红褐色钙化结节,茜素红染色结果为阳性。7.HE染色：成软骨诱导14d见类软骨结节的外周细胞胞圆质少,核较小,部分细胞已失去细胞质和细胞核形成空壳,细胞外基质蓝染,呈类似透明软骨细胞样外观。8.Ⅱ型胶原免疫组织化学染色：可见细胞质内有呈黄色颗粒阳性细胞,阳性细胞率达70%以上.9.阿利新蓝染色：阿利新蓝染色可见大多数细胞胞质及胞外基质被染成明显的蓝色采用骨质疏松山羊干细胞治疗椎间盘退变结果显示：1.X线检查：B1组及B2组术后1月即开始出现椎间隙变窄,椎间隙高度进行性丢失。术后1、3、6月B1、B2组与A组对比,椎%DHI变化有统计学意义,P<0.05；其中B2组术后与B1组比较也有统计学意义,P<0.05；B3组在术后3、6个月与B1、B2组相比,椎间盘高度有所恢复,差异有统计学意义,P<0.05；B3组术后1个月与正常对照组比较有统计学意义,P<0.05,与B182组对比无显著性差异P>0.05；A组0-12个月各组内对比无统计意义P>0.05。2. MRI检查显示：各组术前比较无统计学意义,P>0.05；术后1、3、6月B1、B2组,与A组T2WI信号强度比较差异均有统计学意义,P<0.05,但B182组之间无显著性差异,P>0.05；B3组术后3、6月与A组比较无显著性差异,P>0.05,与B182组比较均有统计学意义,P<0.05。3.HE染色：B3组术后6个月纤维环板层结构比较清晰,纤维排列整齐、细胞数目增多,基质高密度染色较深,髓核细胞核深染胞浆淡染；而B1组术后6个月的板层分界模糊,髓核缩小,纤维排列不规整,髓核陷窝样结构欠规则、减少,细胞减少,基质密度低染色浅。4.Ⅱ型胶原免疫组化染色分析：术后1、3、6月B1组灰度值为160.13±1.66、177.44±3.24、192.69±4.24；B2组为168.93±3.76、188.81±3.47、201.29±4.85；B3为159.20±5.67、147.80±5.00、140.69±1.58；A组为136.36±3.80、135.69±2.65、134.36±3.14,术后1、3、6月时B3组与其余组之间均有统计学意义P<0.05；B2组与B1组也有统计学意义,P<0.05,且与A照组比较均有显著性差异,P<0.05；除正常对照组外,其余各组组内比较也有统计学意义,P<0.05。结论：1.采用双侧卵巢切除去势方法约1年左右可以成功构建山羊骨质疏松大动物模型,联合应用双侧卵巢切除+激素肌注+低钙饮食可以较快地建立起山羊骨质疏松动物模型。2.采用注射生理盐水的纤维环穿刺方法半年左右可以在大动物身上成功构建椎间盘退变模型。以较大号(14G)穿刺针穿刺纤维环在1年左右也能构建出山羊椎间盘退变模型,同时以纤维环穿刺+髓核抽吸方法也可构建山羊椎间盘退变大动物模。3.在骨质疏松过程中可能会不可避免地引起轻度的椎间盘退变情况的发生,在同时有椎间盘退变其它致病因素(或已经发生了椎间盘退变)情况下可加重椎间盘退变进程。但不能确定椎间盘退变是否会加重骨质疏松进展。4.经全骨髓法培养的BMSCs,可为椎间盘组织工程提供较理想的种子细胞。利用藻酸盐凝胶包封处理骨质疏松山羊的骨髓间充质干细胞并移植入山羊退变椎间盘中,可以有效抑制椎间盘的进一步退变。