论文部分内容阅读
L-酪氨酸是一种重要的芳香环平台化合物,广泛应用于食品、医药以及化工等领域。由于天然微生物合成积累L-酪氨酸的能力很低,研究从生物质碳源如葡萄糖到L-酪氨酸途径的全局代谢优化,构建高产L-酪氨酸代谢平台,并应用于衍生物的合成具有重要意义。本文基于模块化代谢工程的理念,设计并合成了BldgBrick模块组装系统,构建了包含L-酪氨酸代谢途径、糖转运系统、TCA循环以及抗逆性基因等12个基因在的四个模块。通过对模块之间适配性的筛选发现,由LacUV5启动子控制aroGfbr-tyrAfbr-aroE组成的模块1和由trc启动子控制的ppsA-tktA-glk组成的模块2组合在一起的pYBT5质粒适配性最佳。利用λ Red同源重组技术,通过连续基因敲除,构建了ptsG、tyrR、pykA、pykF和pheA的5个不同缺失的BAK底盘菌株。模块与底盘细胞的适配性表明,pYBT5与BKT5菌株为最优L-酪氨酸工程菌株,发酵72h,L-酪氨酸产量为702mg/L,产率达到理论得率19.5%。利用人工设计anti-csrA sRNA2沉默E. coli csrA基因,提高L-酪氨酸产量约1.2倍。以L-酪氨酸为平台化合物,重新设计了由4-羟基苯乙酸间位羟化酶基因(hapBC)和突变的D-乳酸脱氢酶基因(d-ldhY52A)组成的人工丹参素合成模块,构建了丹参素工程菌株BKD5。发酵72h的丹参素产量达7.14g/L,产率为0.47mol/mol葡萄糖。本文采用合成生物学,通过代谢途径模块化和底盘构建双向策略,实现了L-酪氨酸全局代谢途径优化,提高了L-酪氨酸的产量。而新途径的创建,实现了L-酪氨酸衍生物丹参素的高效合成。所构建的L-酪氨酸代谢平台具有稳定性与高效性,可应用于合成其他L-酪氨酸衍生物。