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本文从南极中山站排污入海口(ZSS)沉积物样品中直接提取环境样品微生物总DNA,大小在48Kb以上。经过吹打调整DNA片段大小(到30-45Kb)后构建了ZS cosmid宏基因组文库,获得了约6500个阳性克隆子。推算该DNA文库的总容量为228Mb,可以覆盖约10株类似E.coli菌株的总基因组。
采用蛋白酶活性筛选功能板筛选该文库我们得到了一个编号为1146的阳性克隆能够分解底物脱脂牛奶,在筛选平板上产生清晰的透明水解圈。DNA测序后分析表明该克隆外源DNA包含一个由425个氨基酸编码组成的蛋白质的完整的开放阅读框(ORF),GC含量为50.6%。BLAST软件分析该外源DNA包含一个完整的碱性蛋白酶基因,预测该蛋白质的分子量Mw为44.833kD。PCR扩增了蛋白酶基因的DNA序列并连接到大肠杆菌表达载体pET-His上,在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了表达,并对该酶的生化特性进行了研究。酶学数据表明克隆1146所产碱性蛋白酶最适作用pH值为9.0,最适温度为60℃。在50℃条件下具有较好的耐热性。我们将该DNA片段所编码的基因命名为ACPR0001基因,将该DNA序列在Genbank数据库中进行登记,登记号为FM163400。
为获得在活力,以及热稳定性、pH值等方面发生正向突变的突变株,我们用易错滚环复制方法对该蛋白酶的定向进化进行了初步的研究,获得了800个克隆,但并没有获得发生正向突变的克隆,该工作还在进行当中。