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DNA是生命体的主要遗传物质,生命的传递是以DNA的准确复制为前提。DNA在复制时会受到很多内外因子的干扰,内在的如DNA复制屏障,外在的如紫外线、化学药物等。受到干扰的DNA复制会停顿下来直到干扰及其造成的损伤完全修除以后才继续复制。DNA复制叉停顿后,维持这些复制叉的稳定就显得尤为重要,如果DNA复制叉最终坍塌导致不能继续复制,那么就会引起DNA复制不完全,进而导致基因组的不稳定,引发细胞癌变或死亡等。 细胞周期检验点在维持DNA的稳定性方面发挥重要的作用。研究发现,当细胞周期检验点通路被破坏时,约10％的DNA复制叉会发生倒转,从而导致DNA复制叉的坍塌。但是,细胞周期检验点通路稳定停顿的DNA复制叉的调控蛋白底物始终还没有找到,因此寻找细胞周期检验点的调控底物蛋白是现在细胞周期研究领域的热点之一。本课题的一个重要成就就是发现Dna2蛋白同细胞周期检验点的重要磷酸激酶Cds1Chk2蛋白一样,其缺失会导致约8-9％的DNA复制叉的倒转;进一步的研究发现Cds1蛋白可以直接磷酸化Dna2蛋白并使磷酸化修饰后的Dna2蛋白紧密结合在染色质上:借助质谱的方法,分别从体内和体外鉴定出Dna2的关键磷酸化位点为第220位的丝氨酸。将220位的丝氨酸突变为不能被磷酸化的丙氨酸后,酵母细胞呈现出对羟基脲的敏感性;而将该丝氨酸突变为模拟磷酸化的天冬氨酸之后,cds1-的酵母细胞对羟基脲的敏感性则能得到一定程度的补救。并且,突变为丙氨酸的Dna2蛋白会从染色质上脱落下来,从而引起DNA复制叉倒转的积累。体外生化实验分析的结果表明:Dna2蛋白的核酸酶活性而不是解旋酶活性对酵母细胞的生长是必需的,并且也是其核酸酶活性对Dna2细胞维持停顿的DNA复制叉的稳定性是必需的。 在人细胞系中的研究表明,人细胞中Dna2蛋白也可以起到防止复制叉倒转的作用。这说明Dna2稳定停顿DNA复制叉的功能是保守的。 由此可得出结论,Dna2蛋白是一个新的细胞周期检验点通路调控底物蛋白,它可以稳定停顿的复制叉,防止复制叉倒转。 另外,我还研究了Rqh1和Dna2蛋白的共同作用。我的研究表明这两个蛋白可以形成一个核酸酶一解旋酶复合体,切除复制叉倒转中短的倒转双链臂,从而修复倒转的复制叉,使倒转的复制叉也可以重新开始起始复制。 这些研究推进了现阶段科学界对S期细胞周期检验点在维持DNA复制叉稳定性的机理的理解,促进了细胞基因组稳定性相关方面的研究,为癌症研究提供了可能的靶位点蛋白。