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乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)引起的一种严重影响人类健康的传染病,且慢性乙型肝炎病毒感染是一个困扰全球的健康问题。临床上对乙型肝炎的诊断有多种方法,主要是通过血清学方法对HBV初步诊断,其中包括酶免疫法、放免法、化学发光法、免疫荧光法等,目前应用较广、较普及的是酶免疫法。然而,乙肝酶免检测试剂盒中检测抗体均为哺乳动物抗体,而且哺乳动物IgG能与人血清中Fc受体、类风湿因子和蛋白激酶A/G等发生非特异性反应,并能激活哺乳动物补体,从而增加假阳性反应,使检测结果不准确。因此,开发新的HBV检测方法势在必行。本研究用乙肝病毒表面抗原(HBsAg)免疫产蛋鸡,获得抗HBsAg特异性鸡卵黄免疫球蛋白(IgY),并对其进行辣根过氧化物酶标记,作为夹心ELISA的检测抗体,初步建立检测HBsAg的双抗体夹心ELISA方法。首先,本试验以HBsAg作为免疫原,免疫100日龄的罗曼氏产蛋鸡,当在卵黄液中产生较高滴度特异性抗HBsAg IgY抗体时,收集高免鸡蛋进行卵黄抗体的分离纯化。以免疫当天为0天,分别在免疫后2周和6周后各加强免疫1次,共免疫三次,免疫均采用鸡胸部肌肉多点注射,首次免疫使用弗氏完全佐剂,加强免疫使用弗氏不完全佐剂,每次免疫0.5mL HBsAg疫苗(含HBsAg20μg)只。在免疫前3天收集鸡蛋作为对照,免疫期间每天收集鸡蛋于4℃保存备用。将所收集高免鸡蛋卵黄液用pH=5的盐酸水溶液稀释10倍,静置6小时后4℃离心,取上清液,分别用55%和33%的饱和(NH4)2SO4溶液进行盐析,粗提后的组分经Sephadex G-150凝胶柱层析。使用含有0.14mol/LNaCl、0.02mol/L的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液(pH=7.0)作为洗脱剂,流速为22滴/分钟,上样量为1ml,分段收集,取第一个峰的样品。经分光光度法和SDS-PAGE测定制备的IgY样品,结果表明,所得样品可溶性蛋白含量为0.72mg/mL卵黄、平均相对分子质量约为165KD。用间接ELISA法测定制备的IgY样品的抗体滴度为1：12800。然后,试验经改良过碘酸钠氧化法,用HRP(辣根过氧化物酶)对抗HBsAg鸡卵黄抗体进行标记,得到标记物HRP含量为0.24mg/mL,IgY含量为0.54mg/mL,克分子比值为1.76,标记率为54.31%。用直接ELISA法测定HRP标记的抗HBsAgIgY抗体滴度为1：400。本研究利用抗HBsAg的单克隆抗体作为包被抗体和HRP标记的抗HBsAg鸡卵黄抗体作为捕获抗体,初步建立了检测HBsAg的双抗体夹心ELISA方法,并对其反应条件进行了优化,结果如下：(1)方阵滴定实验确定捕获抗体的最佳浓度为1：4000,检测抗体的工作浓度为1：50；(2)4℃包被过夜；(3)封闭液采用1%脱脂奶粉-PBST;(4)以1%脱脂奶粉-PBST-4%PEG6000作为酶标抗体稀释液；(5)底物最佳作用时间为室温15分钟。并对建立的双抗体夹心ELISA方法进行方法学评价,检测灵敏度为2.5ng/mL,批内变异系数为4.72%,批间变异系数为13.14%,与鸭病毒性肝炎病毒作交叉反应实验,表明该ELISA方法特异性(10%)好。应用本研究建立的双抗体夹心ELISA检测43份人血清样本,与市售试剂盒测定结果一致。上述结果表明,本试验成功地用水稀释—两步盐析—凝胶过滤法制备了较高纯度的抗HBsAg鸡卵黄抗体,并用HRP对其进行标记,初步建立了检测HBsAg的双抗体夹心ELISA方法,为HBV检测的研究提供新的方法和思路,为人类及哺乳动物疾病的诊断检测研究奠定理论和实验基础。