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背景和目的:血管新生是血管生成的模式之一,是指从原有的血管芽生出新血管的复杂过程,包括细胞外基质降解、内皮细胞的增殖和迁移、内皮细胞形态分化形成血管腔。最近有一系列研究证明,心肌肥大的病理生理发展过程中伴有一定程度的血管新生。心肌营养素-1(Cardiotrophin-1,CT-1)是白介素-6细胞因子超家族的成员之一;目前,有关CT-1的研究主要集中在CT-1与心肌肥大的关系上,对于其是否具有促血管新生的作用仍不明确。血管新生涉及一系列信号转导途径的激活,ADMA/DDAH信号通路是其中重要的通路之一。CT-1是否通过ADMA/DDAH信号通路促进血管新生以及ADMA/DDAH信号通路在CT-1促血管新生作用中扮演的角色及地位仍不清楚。本研究旨在通过构建CT-1基因真核表达载体,并通过脂质体介导转染至人脐静脉内皮细胞(Human umilical vein cells,HUVECs),初步探讨CT-1基因是否具有促进内皮细胞增殖、迁移和血管腔形成的能力,并从分子水平进一步探讨ADMA/DDAH信号通路是否能调控CT-1所诱导的血管新生,为缺血性心脏病的防治提供新的治疗靶点和思路。方法:(1)构建pEGFP-N1-CTF1-GFP重组质粒及pEGFP-N1对照质粒,通过脂质体将 pEGFP-N1-CTF1-GFP 和 pEGFP-N1 瞬时转染至 HUVECs。(2)实验分四组:①HUVECs组:正常对照组;②GFP组:转染质粒pEGFP-N1;③CT-1组:转染质粒pEGFP-N1-CTF1-GFP;④CT-1+ADMA组:转染质粒pEGFP-N1-CTF1-GFP后24h,加入100μmol/L ADMA至细胞培养基中干预。(3)转染48h后,用MTT法测定细胞的增殖能力;Transwell法测定细胞的迁移能力;体外血管腔形成实验检测血管腔形成能力;同时收取细胞样本,分别用qRT-PCR和Western blot检测CT-1以及其它相关基因的mRNA和蛋白表达水平;高效液相色谱法检测ADMA含量及DDAH活性,亚硝酸盐法检测NOS活性与NO浓度。(4)实验数据以均数±标准差表示,用SPSS14.0统计学软件对实验结果进行多组间单因素方差分析或t检验,P<0.05有统计学意义。结果:(1)PCR鉴定及DNA 测序表明,CT-1真核表达载体pEGFP-N1-CTF1-GFP构建成功;将pEGFP-N1-CTF1-GFP转染至HUVECs 48h后,转染效率达到40%-60%,qRT-PCR和Western blot结果显示CT-1的mRNA和蛋白水平明显上调。因此,本实验选择转染质粒48h作为进一步研究的时间点。(2)MTT法、Transwell法和血管腔形成实验分别显示高表达CT-1的内皮细胞的增殖率、迁移指数和血管腔形成数目明显高于对照组细胞;而高表达CT-1的HUVECs同时给予ADMA干预后,内皮细胞的增殖率、迁移指数和血管腔形成数目有所降低。(3)高表达CT-1的内皮细胞中VEGF、DDAH I和DDAHII的蛋白表达水平明显高于对照组细胞,其DDAH活性也高于对照组细胞;细胞上清中ADMA水平随着CT-1的表达上调而降低;同时高表达CT-1使内皮细胞中eNOSmRNA水平、NOS活性以及NO浓度得到了明显提高;而高表达CT-1的HUVECs同时给予ADMA干预后,部分抑制了高表达CT-1所产生的这些效应。结论:(1)CT-1真核表达载体构建成功,能在HUVECs细胞中有效表达。(2)高表达CT-1能明显促进HUVECs增殖、迁移及血管腔形成;CT-1可能具有促进血管新生的能力。(3)高表达CT-1可能通过ADMA/DDAH信号通路调控血管新生的病理生理过程,为治疗缺血性心脏病提供新的治疗思路及靶点。