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研究背景和目的中耳炎(Otitis media,OM)是一种由细菌或病毒感染引起的中耳(包括中耳腔及听小骨)的炎症,多发于儿童。主要包括急性中耳炎(Aacute otitis media,AOM)、渗出性中耳炎(Otitis media with effusion,OME)及慢性化脓性中耳炎(Chronic suppurative otitis media,CSOM)。由于其病因复杂、症状多样、诊断困难、并发症多,因此临床对于OM尚无统一的治疗方案。目前常规治疗大多采用抗生素、抗组胺、抗充血及抗炎等药物联合治疗。在OM的发病机制中,细菌或病毒产物能激活中耳细胞炎症反应,促进中耳上皮细胞释放炎症介质如细胞因子及炎症趋化因子类,形成炎症瀑布级联效应,这些细胞因子或炎症介质可提高血管通透性、提高细胞ROS水平,导致OM的发生,因此,调节这些炎症因子或能有效治疗OM。尽管存在着争议,大量临床试验证明,糖皮质激素能有效治疗各种类型的OM。糖皮质激素发挥效应主要与下列机制有关:通过抑制花生酸及其代谢产物的形成而发挥直接抗炎作用,从而抑制炎性介质的合成;促进耳咽管表面活性物质释放,促进淋巴组织及淋巴管收缩,从而改善咽鼓管的功能,降低中耳液的粘性;通过上调中耳上皮细胞钠通道运输,促进中耳腔渗出液的排出;潜在的抗过敏效应。一些临床试验已经证明全身性或鼻内给予糖皮质激素配合抗生素治疗在短期内能快速有效改善OME症状。因此,本研究旨在证实糖皮质激素对LPS诱导的HMEECs炎症应答的影响,以及对OME患儿的治疗效应,以指导临床治疗方案的制定。人中耳上皮细胞(Human middle ear epithelial cells,HMEECs)在维持中耳腔气压并保持中耳干燥中起着重要的作用。当中耳腔的换气功能受损,中耳上皮细胞会发生炎症反应,分泌大量的炎症介质,导致中耳上皮细胞离子转运及液体吸收功能降低,进而导致中耳腔积液,发生OME。上皮钠通道蛋白(Epithelial sodium channel,ENaC)是分布中耳上皮细胞膜上的重要的Na+通道,在HMEECs液体吸收中起着重要的作用。研究报道,糖皮质激素可作用于中耳上皮细胞膜中的钠通道蛋白(ENaC),通过上调其下游基因SGK1、Nedd 4-2,11β-HSD1,进而促进 α-、及 β-γ-ENaC 的表达,从而促进中耳上皮细胞液体的吸收。此外,细胞核因子-κB(Nuclear Factor-κ B,NF-κB)被证明能调节大量与炎症有关的基因,是细胞炎症反应相关最重要的因子之一,在调节各时相炎症应答中起着关键性作用。然而,糖皮质激素对NF-κ B信号通路的调节对OM炎症反应的影响尚缺乏相关的文献报道。因此,为探讨糖皮质激素发挥治疗效应的的机制,本研究旨在探讨糖皮质激素对中耳上皮细胞液体吸收功能的影响,以及对NF-κ B信号通路激活的影响。研究方法1.糖皮质激素对脂多糖诱导的中耳上皮细胞炎症反应的影响研究:HMEECs加入LPS刺激6h后,加入5 μM糖皮质激素继续孵育24h,MTT法检测细胞增殖活性;Annexin-V/PI双染流式细胞技术测定细胞凋亡;细胞内总ROS通过DCFH-DA法检测;通过RT-qPCR及Western Blot研究凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-7)及细胞炎症因子(IL-6、TNF-α、COX-2)的基因及蛋白表达水平。2.糖皮质激素治疗脂多糖诱导的中耳上皮细胞炎症的机制研究:通过测定细胞对100 μL液体吸收后剩余液体容积,评价细胞的液体吸收能力;RT-qPCR及Western Blot研究ENaC亚单位及其下游调节基因SGK1的基因及蛋白表达水平;研究NF-κ B信号通路中I κ Bα及p-NF-K B的转录及蛋白水平;予以糖皮质激素干预的同时,给予NF-κB信号通路的激活剂PMA,研究细胞炎症介质TNF-α、IL-6及COX-2的mRNA表达水平。3.糖皮质激素对渗出性中耳炎患儿的治疗效应研究:选取54例OME患儿作为研究对象,采用耳镜检查、鼓膜压力测量及听力检测等诊断OME及评价治疗效果,采用抗生素联合糖皮质激素治疗与抗生素联合安慰剂进行随机双盲对照试验,比较治疗2周后中耳渗出液情况及血清炎症因子IL-6、TNF-α及COX-2的水平。研究结果1.糖皮质激素对脂多糖诱导的中耳上皮细胞炎症反应的影响研究:糖皮质激素处理能显著提高LPS诱导的HMEECs细胞的存活率的降低(与LPS组比较约提高14-20%);LPS能显著促进诱导凋亡相关蛋白Bax(约提高3.37倍,P<0.0001)、Caspase-3(约提高 2.87 倍,P<0.01)及 Caspase-7(约提高 3.34倍,P<0.01)的表达,抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达(约降低48.4%,P<0.001),从而促进细胞凋亡。而糖皮质激素能有效抑制LPS诱导的中耳上皮细胞凋亡(与单纯LPS组比较,总凋亡率约降低3.7%),降低促凋亡蛋白Bax的基因及蛋白的表达(约降低41.1%),促进抗凋亡蛋白Bcl-2的基因及蛋白表达,下调LPS诱导的凋亡相关蛋白Caspase-3及Caspase-7表达水平的升高(分别约降低31.7%及30.3%);LPS刺激能显著提高HMEECs细胞内总ROS浓度(约提高2.78倍),而LPS+糖皮质激素处理组细胞内ROS荧光强度显著低于单纯LPS组(与LPS组比较约降低52.1%);LPS能促进细胞炎症介质IL-6、TNF-α及COX-2的表达水平(分别约上调3.27、3.11及3.44倍),而糖皮质激素治疗组的炎症介质水平显著低于单纯LPS处理组(与LPS组比较分别约降低15.7%、28.3%及 38.1%)。2.糖皮质激素治疗脂多糖诱导的中耳上皮细胞炎症的机制研究:糖皮质激素显著促进正常中耳上皮细胞ENaC亚单位α-ENaC、β-ENaC及γ-ENaC的转录及蛋白表达的升高(分别约提高1.94、3.12及1.45倍),糖皮质激素处理的HMEECs其ENaC下游调节基因SGK1的表达约上调2.59倍;正常HMEECs细胞液体吸收率约为1.81 ± 0.25 μL/cm2/h,LPS处理能降低细胞的液体吸收率(1.46 ± 0.11 μL/cm2/h,P<0.05),糖皮质激素处理显著提高细胞的液体吸收率(2.53± 0.24 μL/cm2/h),该现象可以被糖皮质激素拮抗剂米非司酮所逆转,糖皮质激素+米非司酮+LPS(2.01±0.17μL/cm2/h);LPS刺激显著抑制HMEECs细胞Iκ Bα表达水平(约降低44.1%),而上调p-NF-κ B的表达水平(约提高4.2倍),然而糖皮质激素处理LPS刺激后的HMEECs能显著上调I κ Bα表达水平(与单纯LPS组比较约提高4.14倍),而显著下调p-NF-κB表达水平(与单纯LPS组比较约降低42.4%);NF-κB信号通路激活剂PMA有效抑制糖皮质激素的抗炎效应,上调细胞TNF-α、IL-6及COX-2的mRNA表达水平(与LPS+糖皮质激素组比较分别约上调1.56倍、1.21倍及1.26 倍)。3.糖皮质激素对渗出性中耳炎患儿的治疗效应研究:泼尼松龙+阿莫西林治疗组中(N=29),有12例(41.3%)患儿在第2周无明显的中耳渗液(MEE),安慰剂+阿莫西林组中(N=25)有7例(28%)的患儿无MEE,组间具有显著性统计学差异(P=O.024<0.05);泼尼松龙+阿莫西林与安慰剂+阿莫西林两种方式治疗2周后,其血清炎症介质TNF-α、IL-6及COX-2浓度显著均低于治疗前(P<0.01或P<0.05),而治疗2周后,泼尼松龙+阿莫西林治疗组血清炎症介质的浓度显著低于安慰剂+阿莫西林治疗组(P<0.05)。主要结论1.LPS能通过促进炎症介质的表达,诱导中耳上皮细胞发生炎症反应,进一步通过上调促凋亡蛋白的表达,下调抗凋亡蛋白的表达,从而促进中耳上皮细胞凋亡,降低细胞存活率。糖皮质激素能有效抑制LPS诱导的细胞炎症反应,降低Bax/Bcl-2及Caspase-3/-7介导的细胞凋亡,从而促进细胞存活。2.糖皮质激素通过上调SGK1基因及蛋白的表达从而促进中耳上皮细胞Na+转运蛋白ENaC所有三种亚基的表达,进而促进细胞Na+转运及液体吸收能力;另一方面,糖皮质激素能有效抑制Iκ Bα的降解,抑制LPS刺激诱导的中耳上皮细胞NF-κ B信号通路的激活。3.糖皮质激素与抗生素联用能有效发挥联合抗炎效应,降低OME患儿血清炎症因子IL-6、TNF-α及COX-2的水平,提高OME的治愈率。