论文部分内容阅读
随着国内二胎政策开放及人口老龄化,临床上对婴幼儿、孕妇、老年人的营养筛查需求量越来越大,其中贫血项目和维生素D的检测为营养素检测的重点。该类检测由于原料来源较少、价格昂贵、小分子的释放工艺不稳定、小分子的标记工艺难度大等原因,国内自主研发的产品极少,市场被进口厂家垄断;同时,检测配套的大型发光仪成本较高,项目在国内基层医院开展难度大。针对国家近些年提出的进口产品国产化替代及医疗下沉等政策,本论文选择营养素的检测和配套的单人份检测仪器作为切入点,开展了四种重要营养素的高灵敏免疫检测技术及配套检测仪器的开发和应用研究。采用毕赤酵母表达系统表达了具有生物活性的内因子,同时采用高效的提取方法,从牛奶中提取纯化得到高生物活性的叶酸结合蛋白,这两种蛋白原料的成功制备解决了检测方法的技术瓶颈;在获得营养素检测必要的生物原料基础之上,开发了高灵敏的营养素免疫检测方法,并将其在自主研发的单人份全自动化学发光仪上进行整合调试和验证;同时,本论文还创新研发了指尖血预处理技术,避免了婴幼儿的静脉采血,使得25-羟基维生素D检测能够在临床科室内广泛推广。本论文主要研究内容分为以下几部分:(1)营养素检测重要生物原料的制备。内因子和叶酸结合蛋白的基因序列经过毕赤酵母种属优化后,将其构建至载体p PICZαA中,经过质粒线性化后同源重组导入毕赤酵母,构建了表达菌株p PICZαA-IF/GS115和p PICZαA-FBP/GS115,经甲醇诱导成功表达了内因子,表达量为0.14g/L,纯化后的内因子活性约为国外报道的115%。对于表达失败的叶酸结合蛋白,采用将叶酸分子偶联至琼脂糖凝胶填料表面的提取法来吸附牛奶中的叶酸结合蛋白,填料装柱经洗脱纯化后,成功获得高活性的天然叶酸结合蛋白,每升牛奶可提取0.34 mg,活性约为国外报道的137%。(2)高灵敏的营养素免疫检测方法及自主单人份全自动化学发光仪的研发。采用了竞争法建立人血清中叶酸的定量检测方法,实验优化了血清中叶酸的释放工艺、Biotin-FBP及FA-HRP的标记工艺、Biotin-FBP及FA-HRP的使用浓度、孵育时间等因素。该方法空白限为0.41 ng/m L;企业参考品1和2偏差均小于5%;日内及日间精密度均小于15%;特异性较好,与甲氨蝶呤、氨基碟呤及亚叶酸的交叉反应率均小于0.1%;试剂热稳定性良好,37℃放置七天信号值下降小于15%。采用了竞争法建立人血清中维生素B12的定量检测方法,实验优化了血清中维生素B12的释放工艺、Biotin-IF及VB12-HRP的标记工艺、Biotin-IF及VB12-HRP的使用浓度、孵育时间等因素。所建立方法的空白限为42 pg/m L;企业参考品1和2偏差均小于8%;日内及日间精密度均小于15%;与羟钴胺素的交叉反应为45.96%,与维生素B1、维生素B2、维生素C的交叉反应率均小于0.1%;试剂热稳定性良好,37℃放置七天信号值下降小于15%。采用了双抗夹心法建立人血清中铁蛋白的定量检测方法,实验制备了生物素化捕获抗体及酶标记抗体并优化了其使用浓度等。该检测方法的空白限为1.53 ng/m L;企业参考品1和2的检测偏差均小于5%;日内及日间精密度均小于10%;试剂热稳定性良好,37℃放置七天信号值下降小于10%。采用竞争法建立了25-羟基维生素D的定量检测方法,实验制备了抗体包被板、SA-HRP,并优化了Biotin-VD、SA-HRP的使用浓度和孵育时间等。该方法的空白限为3.16ng/m L;企业参考品1和2的检测偏差均小于6%;日内及日间精密度均小于15%;试剂热稳定性良好,37℃放置七天光信号值略有升高趋势,变化小于15%。本课题研发的全自动单人份化学发光免疫分析仪加样准确、重复性好;读数器件光学噪声低;温度控制准确、稳定,波动度为0.7℃;反应微孔板的洗涤方式良好,残留量低;根据本课题采用的HRP体系优化了读数等待时间和曝光时间分别为60秒钟和0.5秒钟。本论文所研究的检测方法,因检测试剂形式为单人份检测试剂条,产品不受开瓶稳定性的影响,有效解决基层医院因样本量少而导致传统试剂浪费严重的问题。(3)营养素检测方法与单人份全自动化学发光仪的自动化匹配调试研究。设计开发了贫血三项的检测试剂条,并将叶酸、维生素B12、铁蛋白三项检测程序与自主研发的单人份全自动化学发光仪进行匹配调试,使三项可随机上样、同时检测、同步出结果。该三项上机调试后,企业参考品的检测结果偏差均<10%,日内日间精密度均<15%,检测结果与进口对照产品也有较高的相关性,r~2均>0.95。25-羟基维生素D检测方法与全自动化学发光仪匹配调试后,企业参考品的检测结果偏差均<8%,日内日间精密度分别<10%和<15%,临床检测结果与进口产品相关性较好,r~2>0.95,完全满足国内产品注册申报要求。另外,利用开发的毛细管离心的全血前处理方法,初步实现了婴幼儿指尖血的采集和定量;且全血样本的准确度和精密度也基本满足临床需求,与血浆检测结果高度一致,有效解决了临床上婴幼儿患者的采样和检测难题。(4)营养素检测试剂与配套仪器的临床评价试验。四项营养素检测试剂与配套的单人份全自动化学发光仪临床评价结果表明:检测结果与参比试剂检测结果有较高的一致性,符合产品注册申报临床评价标准,试剂及仪器匹配的检测结果具有很高的可靠性和安全性。