研究背景随着慢性肾脏病的(CKD)发病率增加,CKD已经成为全球性的公共健康问题。高血压是肾实质疾病最常见的继发疾病,一直以来,血容量过多与肾素-血管紧张素系统(RAS)的激活被认为是肾性高血压的主要决定因素,对大多数肾性高血压患者,控制这两个因素均可以降低血压。最近的研究显示,中枢交感神经系统(sympathetic nervous system,SNS)活动的增加参与了慢性肾功能衰竭(CRF)高血压的发生。越来越多的研究表明,中枢神经系统对血压调节机制的障碍导致了交感神经活性的持续增加,进而导致慢性高血压。中枢与血压调节相关的主要核团包括：缺乏血脑屏障的穹窿下器(SFO),下丘脑室旁核(PVN)、脑干延髓头端腹外侧核(RVLM)和孤束核(NTS)。PVN核团是交感神经活动和心血管活动的重要整合中枢,在调控交感神经活动和血压中起重要作用。血管紧张素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ)是RAS系统的主要活性肽,是促进血压增高的强有力的成分,Ang Ⅱ通过多种机制升高血压,包括血管收缩、钠潴留、血管重塑和增加交感神经活动。Ang Ⅱ的增压作用由AT1受体(AT1R)介导,包括直接的血管收缩作用和刺激其它增压激素的释放,并参与导致心血管张力增加的其它机制。此外,作为一种神经肽,Ang Ⅱ能够通过刺激AT1受体,增加下丘脑和脑干部位心血管调节中枢神经元的兴奋性。AngⅡ与AT1R的结合强烈地活化了促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAP激酶,MAPK)细胞内信号通路。目前在哺乳动物中研究的最多的MAPK通路是ERK1/2,JNKs及p38通路。MAPK信号通路在脑的正常发育过程中调节着多种细胞生物过程如基因的表达,增殖、分化、生存及死亡等功能。有研究证明了在AngⅡ升高引起的高血压模型中,MAPK信号通路被激活。在自发性高血压大鼠模型中,去甲肾上腺素(NE)可以诱导MAPK增加,同时可以诱导原癌基因产物Ras活性蛋白的增加。Ras相关GTP结合蛋白超家族是一类低分子量蛋白质,分子量约为20-25kD,能够非常紧密地结合在鸟苷酸上,同时在非活性状态的GDP结合形式和活性状态的GTP结合形式之间循环。Ras蛋白几乎分布在所有类型细胞上,包括成纤维细胞和肌肉细胞,它可以激活信号转导途径调节细胞增殖、分化和存活。除了在细胞增殖和分化方面的功能,近来研究表明,分子量为21KD的Ras蛋白也参与了细胞程序性死亡的发生.细胞凋亡是近年逐渐被认识的一种细胞死亡方式,是一种基本生物学现象,在多细胞生物去除不需要的或异常的细胞过程中起着必要的作用。研究显示,高血压是加强脑部氧化应激的一个重要的因素,且高血压和氧化应激之间的循环促进相互作用,高氧化应激状态活化前凋亡机制。长期高血压造成的血管重塑过程中,细胞凋亡是其中重要的组成部分。在压力负荷过重或心衰的动物模型中,局部肾素血管紧张素系统活化是心肌细胞凋亡的关键因素。体外实验和体内实验证明,AngⅡ在肾脏细胞凋亡中起重要作用,阻断AngⅡ可以减弱细胞凋亡。大鼠在高血压的应激状态下会活化前凋亡机制,最终导致神经元丢失。现在一般认为caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶。Bcl-2家族参与了细胞凋亡的调控,Bcl-2蛋白和Bax蛋白均属于Bcl-2家族,Bcl-2是抗凋亡蛋白,Bax是促凋亡蛋白,二者蛋白水平的高低与凋亡调控直接相关。综上所述,鉴于中枢神经系统在高血压发生、发展和血压调控中的重要地位和作用,研究慢性肾功能衰竭状态下中枢神经系统,尤其是脑部RAS系统是否活化,及其控制血压可能的机制,将进一步加深对慢性肾功能衰竭及其他慢性肾脏病高血压的发生机制的认识。本研究首先证实了肾性高血压大鼠脑部PVN部位存在RAS系统的活化,然后进一步证实肾性高血压状态下局部升高的AT1R可以引起细胞凋亡,并且是通过Ras/ERK1/2/caspase-3信号途径介导,并验证这条通路是否参与了交感神经的活化。为了这个目标,我们检测了肾性高血压大鼠和假手术大鼠PVN部位的Ras,p38,ERK1/2,Bax和Bcl-2和caspase-3蛋白的表达。然后我们对肾性高血压大鼠进行侧脑室注射AT1R抑制剂,Ras抑制剂,ERK1/2抑制剂,p38抑制剂和caspase-3抑制剂,观察大鼠血压、交感活性的变化。研究方法第二章肾性高血压大鼠脑核团PVN部位RAS和MAPK及凋亡蛋白cleaved Caspase-3表达的研究1：二步法5/6肾切除(5/6Nx)建立肾性高血压模型1)腹腔注射麻醉大鼠：给大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉,俯卧位定于鼠台上。2)酒精消毒,于大鼠左腹部中1/3脊柱旁开2-3cm处行纵行切口,切口长度约为2-3cm。3)依次切开皮肤和皮下组织,并剪开肌肉暴露肾脏,剥离肾包膜,用无损伤血管钳夹住肾蒂,切除肾脏的上下极约占左肾的2/3,明胶海绵压紧上下极创面止血,放松血管钳,观察创面不再渗血后还纳肾脏回腹腔,逐层缝合肌层及皮肤,酒精消毒手术切口。术后肌肉注射青霉素注射液,预防感染。假手术组只做肾包膜剥离术。4)一周后,在脊柱右侧中1/3旁开2-3cm纵行切口(切口略高于左侧),分离肌层,游离肾脏,无损伤血管钳夹住肾蒂,4号丝线结扎肾蒂,切除右侧肾脏,观察有无出血,缝合肌层和皮肤,酒精消毒手术切口。假手术组只做肾包膜剥离术。2.血压和尿样采集采用股动脉插管法测量大鼠麻醉状态下股动脉血压,处死前最后三天,代谢笼内单只单笼饲养,连续三天收集24h尿液,用于24h尿蛋白定量。3.大鼠脑标本摘取和采血3.1大鼠采血及心脏灌注以3%戊巴比妥钠(35mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠,腹主动脉采血后迅速打开胸腔,16#灌胃针从左心室穿刺入主动脉,同时剪开右心耳,4℃预冷的生理盐水(含肝素20U/ml)200ml快速灌注。3.2组织样本采集3.2.1新鲜样本200ml预冷生理盐水灌注完毕后立即分离大脑,在脑模型中将脑切成薄片,在显微镜下辨认PVN,取出后装入0.5ml的EP管,并保存于-80℃冰箱直至蛋白提取和总RNA提取。3.2.2用于石蜡切片的样本200ml预冷生理盐水灌注后继续以4%多聚甲醛400ml灌注,灌完后取下脑,在脑模型中依据大鼠脑图谱包括且避开研究核团位置初步切成2mm的厚块,后固定6h时后梯度酒精脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,核团部位切成5μm薄片用于后续免疫组化实验。3.3血肌酐检测采用临床自动生化分析仪检测。3.424h尿蛋白定量采用考马斯亮蓝.G250法检测4.Western blotting检测PVN内RAS成分AT1受体、p-ERK1/2及凋亡蛋白caspase-3等蛋白的表达将储存于-80℃内的组织取出,称重,按组织重量：裂解液=1：4的比例加入裂解液,用5m1注射器反复吹打组织,以上操作均在冰上进行,完全裂解后,13000g,4℃,离心15min,提取上层匀浆液,即为PVN组织的总蛋白,加入SDS(5×)上样缓冲液,95℃煮沸蛋白,Western blotting检测ATl受体与p-ERK1/2及凋亡蛋白caspase-3等蛋白的表达。Ras活性蛋白需要先用’Ras Pull-Down and Detection"提纯试剂盒提纯Ras-GTP,再用Western blotting检测。5.免疫组织化学法检测PVN内RAS成分血管紧张素原(AGT)、ATl受体与AngⅡ的蛋白、p-ERK1/2与Bax的表达取每只大鼠PVN石蜡切片各3张,经脱蜡、梯度乙醇水化后进行免疫组织化学染色后显微镜下拍照,Image·Pro Plus软件分析,计数阳性细胞的数量。6.PVN内RAS成分AT1受体、Bax及Bcl-2的mRNA表达的检测取各组大鼠PVN组织放于1.5ml EP管,按组织重量：Trizol=1:10的比例进行反复吹打,提取组织总RNA,逆转录,Real time PCR检测AT1受体、Bax及Bcl-2的mRNA的表达水平。7.统计方法所有数据均代表3次以上重复实验的结果,以mean±SE表示,所有统计分析由统计软件SPSS13.0完成。与常数项比较,采用单样本t检验；两样本均数的比较采用两独立样本t检验。p<0.05为差异有统计学意义。第三章肾性高血压脑核团PVN部位AT1R/Ras/ERK1/2/caspase-3信号通路及其对交感神经活性的研究1.动物模型的制备二步法5/6肾切除(5/6Nx)建立肾性高血压模型,假手术组只做肾包膜剥离术造模期间,每2周尾套法测量尾动脉血压,并通过眼眶静脉采血,检测大鼠血肌酐水平。于第10周对具有高血压的大鼠进行随机分组。具体分组如下(每组n=5)：①Sham组：不予给药②5/6Nx组：不予给药③5/6Nx+aCSF ICV组：人工脑脊液(aCSF)侧脑室注射,速度0.5μl/h④5/6Nx+Losartan ICV组：losartan侧脑室注射,剂量1mg/kg/d,速度0.5μl/h⑤5/6Nx+FTS ICV组：FTS侧脑室注射,浓度1mmol/L,速度0.5μl/h⑥5/6Nx+PD98059ICV组：PD98059侧脑室注射,20μ,ol/l,速度0.5μl/h⑦5/6Nx+SB203580ICV组：SB203580侧脑室注射,100μmol/l,速度0.5μl/h⑧5/6Nx+Z-DEVD-FMK ICV组：Z-DEVD-FMK侧脑室注射,750μmol/L,速度0.5μl/h注释：脑室内注射组药物以aCSF作为溶剂；ICV,脑室内注射；aCSF,人工脑脊液。2.血压和尿样采集在分组后给予不同刺激前,采用股动脉插管法测量麻醉状态下大鼠股动脉血压,作为各组的基础血压；在实验结束前,再次测量大鼠的股动脉血压,血压改变采用阻断处理14天后的股动脉血压与Sham组血压的平均值的差值表示。不同刺激的最后三天,代谢笼内单只单笼饲养,连续三天收集24h尿液,用于24h尿蛋白定量。3.大鼠脑标本摘取和采血3.1大鼠采血及心脏灌注以3%戊巴比妥钠(35mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠,腹主动脉采血后迅速打开胸腔,16#灌胃针从左心室穿刺入主动脉,同时剪开右心耳,4℃预冷的生理盐水(含肝素20U/ml)200ml快速灌注。3.2组织样本采集200ml预冷生理盐水灌注完毕后立即分离大脑,在脑模型中将脑切成薄片,在显微镜下辨认PVN,取出后装入0.5ml的EP管,并保存于-80℃冰箱直至蛋白提取。3.3血肌酐检测采用临床自动生化分析仪检测。3.424h尿蛋白定量采用考马斯亮蓝.G-250法检测4.Western blotting检测PVN内RAS成分AT1受体、p-ERKl/2及凋亡蛋白caspase-3等蛋白的表达将储存于-80℃内的组织取出,称重,按组织重量：裂解液=1：4的比例加入裂解液,用5ml注射器反复吹打组织,以上操作均在冰上进行,完全裂解后,13000g,4℃,离心15min,提取上层匀浆液,即为PVN组织的总蛋白,加入SDS(5×)上样缓冲液,95℃煮沸蛋白,Western blotting检测ATl受体与p-ERK1/2及凋亡蛋白caspase-3等蛋白的表达.。Ras活性蛋白需要先用‘’Ras Pull-Down and Detection"提纯试剂盒提纯Ras-GTP,再用Western blotting检测。5.统计方法数据以mean±SE表示,所有统计由统计软件SPSS13.0完成。假手术和5/6Nx组在不同阻断剂干预14天后的比较,符合方差齐性检验的数据,采用one-way ANOVA,当P<0.05时,用Post Hoc Tests的LSD法进行两两比较；方差不齐时采用Welch检验；当P<0.05时,两两比较采用Dunnett’T3法。P<0.05为差异有统计学意。结果1.造模术后10周大鼠血压及肾功能在术后第十周需要进行干预前,测量尾动脉血压发现CRF大鼠血压已显著高于sham组,CRF组大鼠血肌酐和24小时尿蛋白排泄量也显著升高,证明肾性高血压大鼠造模成功。2.免疫组化技术、western blot技术和Real-Time PCR技术检测sham组及肾性高血压大鼠脑PVN核团RAS的表达免疫组化结果显示,肾性高血压大鼠PVN核团AGT、ANGII及AT1R的表达均高于sham大鼠(P<0.05)；western blot结果显示,与sham组大鼠比较,肾性高血压大鼠AT1R显著升高(P<0.05)；RT-PCR结果显示,与sham组大鼠比较,肾性高血压大鼠AT1R的mRNA水平也是显著升高(P<0.05)。3.Western blot检测sham组及肾性高血压大鼠脑PVN核团Ras-GTP的表达western blot结果显示：与sham组大鼠比较,肾性高血压大鼠PVN核团Ras-GTP的表达显著升高(P<0.05)。4.免疫组化技术和western blot技术检测脑部PVN部位p-ERK1/2及p-p38的表达免疫组化和western blot结果显示,肾性高血压大鼠PVN核团p-ERKl/2的表达均高于sham大鼠(P<0.05);western blot结果显示,肾性高血压大鼠PVN核团p-p38的表达高于sham大鼠(P<0.05)。5. Sham组及肾性高血压组大鼠脑PVN核团Bax、Bcl-2及cleaved caspase-3的表达免疫组化、western blot及RT-PCR结果显示,与sham组大鼠比较,肾性高血压大鼠PVN核团Bax的表达均显著升高(P<0.05);western blot及RT-PCR结果显示,肾性高血压大鼠PVN核团Bcl-2的表达均低于sham大鼠(P<0.05)；凋亡蛋白cleaved caspase-3的western blot结果也显示,与sham组大鼠比较,肾性高血压大鼠PVN核团cleaved caspase-3的表达显著升高(P<0.05)。6.不同阻断处理14天对肾性高血压大鼠生理及血、尿生化指标的影响脑室内注射不同干预剂14天后,不同的阻断处理对大鼠的体重、血肌酐无影响。与肾性高血压大鼠脑室内注射脑脊液的大鼠比较,脑室内注射losartamRas的抑制剂FTS、ERK1/2的抑制剂PD98059、caspase-3的抑制剂Z-DEVD-FMK均能够显著降低血压(P<0.05),显著的抑制血浆NE水平(P<0.05),证明脑室内注射这些干预剂是通过作用于中枢神经系统产生降压作用；但p38的抑制剂SB203580并不能降低血压和降低血浆NE的水平。7. Western blot检测sham组及脑室内注射不同的干扰剂后的肾性高血压大鼠脑PVN核团AT1R的表达为探索AT1R调节高血压和交感神经活性可能的机制,给予肾性高血压大鼠脑室内注射losartan/Ras的抑制剂FTS/ERK1/2的抑制剂PD98059、p38的抑制剂SB203580/caspase-3的抑制齐Z-DEVD-FMK,除了losartan,其他阻断剂均不能降低PVN部位AT1R的水平(P<0.05),说明这些升高的、与疾病相关的蛋白不能调节AT1R的水平。8. Western blot检测sham组及脑室内注射不同的干扰剂后的肾性高血压大鼠脑PVN核团Ras-GTP的表达除Ras的抑制剂FTS能降低Ras活性蛋白Ras-GTP的表达外(P<0.05),只有脑室内注射losartan可以降低Ras-GTP的表达(P<0.05),ERKl/2的抑制剂PD98059、p38的抑制剂SB203580、caspase-3的抑制剂Z-DEVD-FMK均不能降低Ras-GTP的水平。说明在肾性高血压大鼠PVN部位,AT1R可以调节Ras的活化,而其他阻断剂不能调节Ras活性蛋白的水平。9. Western blot检测9. sham组及脑室内注射不同的干扰剂后的肾性高血压大鼠脑PVN核团p-ERKl/2的表达脑室内注射losartan、Ras的抑制剂FTS和ERK1/2的抑制剂PD98059均能降低p-ERK1/2的表达(P<0.05),p38的抑制剂SB203580、caspase-3的抑制剂Z-DEVD-FMK均不能降低p-ERKl/2的水平。说明在肾性高血压大鼠PVN部位,AT1R及Ras均可以调节ERK1/2的活化,而p38的抑制剂SB203580、caspase-3的抑制齐Z-DEVD-FMK不能降低ERK1/2的磷酸化水平。10. Western blot检测sham组及脑室内注射不同的干扰剂后的肾性高血压大鼠脑PVN核团Bax、BcI-2和Cleaved caspase-3的表达脑室内注射losartan、Ras的抑制剂FTS、RK1/2的抑制剂PD98059均能降低Bax的表达(P<0.05),而p38的抑制剂SB203580、caspase-3的抑制剂Z-DEVD-FMK不能降低Bax的表达；脑室内注射losartan、Ras的抑制剂FTS、ERK1/2的抑制剂PD98059均能提高抗凋亡蛋白Bcl-2的表达(P<0.05),而p38的抑制剂SB203580、caspase-3的抑制剂Z-DEVD-FMK不能提高Bcl-2的表达(P<0.05)。脑室内注射losartan、Ras的抑制剂FTS、ERK1/2的抑制剂PD98059和caspase-3的抑制剂Z-DEVD-FMK均能降低Cleaved caspase-3的表达(P<0.05),而p38的抑制剂SB203580不能降低Cleaved caspase-3的水平。说明在肾性高血压大鼠PVN部位,AT1R、Ras及p-ERK1/2均可以调节caspase-3的活化,而p38的抑制剂SB203580不能降低caspase-3的活性形式；综合caspase-3、Bax和Bcl-2的结果可以得出AT1R、Ras及p-ERK1/2参与了细胞凋亡的调控。论文总结1.肾性高血压大鼠中枢核团PVN部位存在RAS的活化；2.肾性高血压大鼠中枢核团PVN部位存在Ras与MAPK信号的活化；3.肾性高血压大鼠中枢核团PVN部位存在神经细胞凋亡；4.肾性高血压大鼠中枢核团PVN部位AT1R的活化可以诱导细胞凋亡,从而导致交感神经活化和血压升高,其机制就是通过Ras/ERK1/2/caspase-3的通路来完成。