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群体感应是指细菌通过向周围环境中释放可自由扩散的小分子量的自体诱导物来监测自身细胞浓度及周围其它细菌数量变化,调控下游特定基因的表达及相关生理活动的一种行为。不同的群体感应系统之间都有一定的联系,它们之间有着十分复杂的调控网络,进而引起物种之间的多样性。目前,在很多根瘤菌中都已经发现了群体感应系统,其中研究的十分透彻的是豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum bv.viciae),由于它同时包含四个群体感应系统(cin, rai, rhi和tra),因此具有相对复杂的调控网络。但对菜豆根瘤菌Rhizobium etli CFN42的群体感应系统尚未有详细的报道。 本文主要以菜豆根瘤菌(Rhizobium etli CFN42)作为研究对象,通过查阅MicrobesOnline数据库,以及对R.etli CFN42基因组序列进行详细的比对,发现R.etliCFN42菌株中至少含有3种luxI家族同源的AHL类自体诱导物合成酶基因,它们分别被命名为cinI, raiI和traI;同时还包括4种luxR家族同源的调控基因,它们分别被命名为cinR, raiR, traR1和traR2。通过与pRA302质粒进行融合,构建Pluxl-lacZ和PluxR-lacZ的启动子翻译融合表达质粒,将这些重组质粒电转化到野生型菌株及luxI/luxR缺失株中,质粒上报告基因lacZ表达的强弱直接反映出该基因启动子被激活的强度。研究发现,cinI的表达严格依赖cinR的调控,raiI的表达严格依赖raiR的调控,traI表达严格依赖traR1traR2的调控。 将cinI, raiI和traI全基因片段分别克隆到具有Ptac启动子的表达质粒pYC12上,电击转化到DH5αλpir中,实现cinI, raiI和traI的超表达,产生的CinI,RaiI和TraI合成酶,它们会合成大量的自体诱导物AHLs。 在cinI, raiI, traI基因缺失株中,分别电转化导入翻译融合质粒PcinI-lacZ, PratI-lacZ和PtraI-lacZ。在培养过程中,分别加入构建在DH5αλpir中三种LuxI类蛋白表达产生的AHLs进行诱导表达。发现CinI产生的AHLs可以诱导所有翻译融合重组质粒中报告基因lacZ的表达。 将cinR, raiR和traR1 traR2全基因片段分别克隆到具有Ptac启动子的表达质粒pYC12上,电击转化至R.etli相关缺失株中,完成cinR, raiR和traR1traR2基因的功能回补。培养过程中,分别加入构建在DH5αλpir中三种LuxI类蛋白表达产生的AHLs诱导luxI-lacZ的表达。研究发现,猜测只有CinI产生的AHLs能够与CinR、RaiR和TraR1TraR2三种调控蛋白结合诱导cinI-lacZ, raiI-lacZ和traI-lacZ表达,而RaiI产生的AHLs只能与RaiR调控蛋白结合诱导raiI-lacZ的表达,同样TraI产生的AHLs也只能与TraR1TraR2调控蛋白结合诱导traI-lacZ的表达。 总而言之,R.etli CFN42群体感应系统中cin系统处于rai系统和tra系统的顶端,cinR是组成型表达。在自体诱导物合成酶基因缺失诱导的情况下,cinI仍有一定的本底水平表达,猜测R.etli CFN42中cinR调控cinI表达可能不依赖于CinI产生的AHLs,对于这个结论尚需更进一步的研究才能确认。 本文还研究了糖类对中慢生华癸根瘤菌(Mesorhizobium huakuaii)As9的群体感应系统mrh的影响。外源的添加葡萄糖或果糖,对菌株的生长具有正向效应,促进菌株的快速生长;同时,一旦外源添加葡萄糖或果糖后,mrhI和mrhR表达水平均明显低于普通培养基培养条件下的表达水平,因此在M.huakuaii As9中,葡萄糖和果糖会抑制群体感应基因的表达。但是随着碳源不断消耗,其对群体感应基因表达的抑制作用也会随之降低。