植物细胞质雄性不育(Cytoplasmic male sterility, CMS)是一种不能产生有活力花粉的遗传现象,属母性遗传,在植物杂种优势利用中具有重要价值。利用胞质雄性不育系、恢复系和保持系的三系配套制种具有省工、方便、种子纯度高、成本较低等优点,这将成为杂种棉商业化制种最有效的途径之一。目前,许多作物利用三系配套进行杂交种子的生产,例如玉米、水稻、洋葱、蓖麻、高粱、油菜和甜菜。棉花作为一种重要的经济作物具有非常明显的杂种优势,可以有效提高产量、改善纤维品质、增强抗逆性。由于棉花三系中的恢复系恢复力不强,所以在应用上受到了很大的限制。因此,棉花细胞质雄性不育恢复基因的克隆对于更好的利用杂种优势,培育优良恢复系,具有重要的理论和实践意义。目前,报道的所有恢复基因都携带线粒体定位信号,但是不一定属于PPR基因。因此,含有线粒体定位序列可能是恢复基因的特征。四倍体棉花中的恢复基因来自野生棉,但是恢复系所对应的保持系和不育系不包含育性恢复基因。本实验室构建了恢复基因Rf1位点的遗传和物理图谱,并结合同源克隆法筛选Rf1物理图谱上的0-613-2R的BAC克隆,检测到一个阳性BAC。将此阳性BAC克隆进行测序,利用在线生物软件预测ORF(开放阅读框)。根据目标基因的特性,同时结合Q-PCR、VIGS(病毒诱导的基因沉默)等技术进行筛选验证。本实验所用的实验材料是孢子体不育体系的0-613-2R(恢复系)、泗棉三号B(保持系)、泗棉三号A(不育系)和不育的哈克尼西棉,配子体不育体系的8518R(恢复系)、8518B(保持系)、8518A(不育系)和三裂棉。通过对BAC测序获得26个contigs,利用在线软件预测到4个含有线粒体定位序列的基因,它们都是PPR基因。其中一个只含有6个PPR重复基序,可能是由于测序不完整造成的基因不完整。将三个预测基因分别命名为ORF2、ORF3和ORF18。对3个基因设计引物,在0-613-2R、泗棉三号B、泗棉三号A、不育的哈克尼西棉和雷蒙德氏棉中进行扩增。结果,保持系、不育系和不育的哈克尼西棉中ORF18序列和恢复系中的差别很大,有许多SNP位点。Yang(2009)研究表明,ORF3只能在0-613-2R和哈克尼西棉中扩增得到。ORF2序列在不育的哈克西棉和保持系雷蒙德氏棉中也扩增得到,排除ORF2为候选基因的可能。另外,ORF2的扩增引物还在0-613-2R中扩增出来一条比预测到的ORF2多105 bp的序列,命名为ORF2-2,它不能在其他材料中扩增得到。利用同源克隆的策略,用同一引物在8518R中进行PCR扩增,结果在ORF2中得到一条序列,而在ORF3中得到2条序列,分别命名为ORF3-1和ORF3-2。由于PPR基因属于家族类基因,对0-613-2R中的4个候选基因(ORF2、ORF2-2、ORF3、ORF18)和8518R中的3个候选基因(ORF2、ORF3-1、ORF3-2)设计SNP引物进行Q-PCR检测,结果只有ORF2-2在0-613-2R和(泗棉三号X 0-613-2R)F1的根、茎、叶和花药中表达。8518R和(8518A X 8518R)F1中也只有ORF2表达。利用VIGS技术进一步验证,将两个候选基因沉默,观察花粉的育性。结果在注射了农杆菌的0-613-2R植株中观察到不育花粉,提取该植株叶片RNA进行定量检测,相对表达量是对照的16%。后来在一植株中发现处于发育早期的花粉和对照的花粉相比,发育比较小,且不饱满,相对表达量只占对照的39%。另外,定量结果表明,在20℃左右的环境下,注射5个月后VIGS开始失去效应。由于8518R植株生长缓慢,VIGS失效之后还没有出现花蕾。