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目的:检测转录因子FOXO4在大鼠软骨细胞中的表达,通过建立有效的软骨细胞退变模型,探讨FOXO4在大鼠软骨细胞退变中的相关性。方法:(1)分别取4周与16周SD大鼠的股骨头软骨,采用Ⅱ型胶原酶分步消化法进行细胞分离培养,以获取正常及自然退变的原代软骨细胞;(2)原代软骨细胞在传至第1代后,使用甲苯胺蓝染色、阿利新蓝染色及Ⅱ型胶原蛋白免疫细胞化学染色等方法进行细胞鉴定;(3)将实验分为3组。对照组:取自4周龄大鼠的第2代软骨细胞;自然退变组:取自16周龄大鼠的第2代软骨细胞;诱导退变组:以终浓度10ng/mL1L-1β对4周龄大鼠软骨细胞从第1代开始进行诱导退变处理,并在传至第2代时继续诱导后进行后续实验;(4)显微镜下观察细胞形态改变,并采用β-半乳糖苷酶染色法进行衰老检测;(5)用RT-PCR分别检测各组软骨细胞中FOXO4和col2α的mRNA表达水平,Western Blot分别检测各组软骨细胞中FOXO4和Ⅱ型胶原蛋白表达水平。结果:(1)4周龄大鼠股骨头软骨与软骨下骨结合较为松弛,易于完整取下,呈半透明状,中部厚实,质地韧而脆,易于切割;16周龄大鼠股骨头软骨与软骨下骨结合致密,软骨明显变薄,不易完整取下,质地坚硬,难以切割。(2)4周龄大鼠的原代软骨细胞48h即有大量细胞贴壁,分布均匀,约在1周时可长满培养瓶底进行传代;16周龄大鼠的原代软骨细胞48h仅有极少散在的细胞贴壁,随后形成簇状聚集并逐渐蔓延,约2周方可长满瓶底。(3)两种软骨细胞在第1代时形态差异不明显,均呈三角形或多角形。甲苯胺蓝染色显示胞浆呈蓝色,细胞核呈深蓝色;阿利新蓝染色显示胞浆呈淡蓝色;Ⅱ型胶原蛋白免疫细胞化学染色显示胞浆呈棕黄色,细胞核呈深棕色。三种软骨细胞鉴定方法均为阳性反应。(4)观察第2代软骨细胞,对照组细胞呈梭形,胞质丰富饱满;自然退变组和诱导退变组细胞呈长梭形或不规则形态。β-半乳糖苷酶染色显示对照组细胞未见明显染色,自然退变组和诱导退变组细胞可见大量细胞呈深蓝色。(5)RT-PCR检测显示:与对照组相比,自然退变组和诱导退变组软骨细胞中col2α的mRNA表达量显著降低[(0.07±0.02)vs(0.53±0.06),p<0.001;(0.15±0.03)vs(0.53±0.06),p<0.001];FOXO4的mRNA表达量显著增高[(0.58±0.03)vs(0.08±0.02),p<0.001;(0.83±0.03)vs(0.08±0.02),p<0.001]。(6)Western Blot检测显示:与对照组相比,自然退变组和诱导退变组软骨细胞中Ⅱ型胶原蛋白的表达量显著降低[(0.14±0.01)vs(0.51±0.02),p<0.001;(0.11±0.03)vs(0.51±0.02),p<0.001];FOXO4蛋白的表达量显著增高[(0.16±0.02)vs(0.08±0.01),p<0.05;(0.21±0.02)vs(0.08±0.01),p<0.01]。结论:(1)自发性退变和1L-1β诱导退变是两种有效的软骨细胞退变模型,可用于软骨退变或骨性关节炎的相关实验研究;(2)转录因子FOXO4可在大鼠软骨细胞中表达;(3)FOXO4与大鼠软骨细胞的退变有关,其表达与软骨退变的程度呈正相关。