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目的:通过small RNA测序技术筛选针刺治疗膝骨性关节炎(Knee Osteoarthritis,KOA)患者差异表达的血清外泌体microRNA,并进行靶基因和信号通路分析,研究针刺治疗对KOA患者血清外泌体microRNA的调控机制。方法:1、本研究共纳入22例KOA患者和12例健康受试者。将KOA患者随机分为针刺治疗组(11例)、等待治疗组(11例)。针刺治疗组选择鹤顶、内膝眼、犊鼻、血海、梁丘、阴陵泉、阳陵泉、足三里进行针刺治疗,3次/周,连续治疗4周,共12次。等待治疗组前4周不进行干预,4周后再行相同的针刺干预。分别于入组0周和入组4周采用西部安大略麦克马斯特大学骨关节炎指数可视化量表(Western Ontario and McMaster Universities Osteoarthritis index,WOMAC评分)对针刺疗效进行评定。2、健康受试者在入组0周时采集血清样本,KOA患者在4周前后分别采集血清样本,超速离心机离心,沉淀在透射电镜下根据形态和大小判定是否为外泌体。采用small RNA测序技术对分离得到的外泌体中的microRNA进行测序,依据P≤0.05,差异倍数高、表达丰度高的原则,筛选差异表达microRNA。筛选和比较的层次如下:(1)比较健康受试者与KOA患者血清外泌体microRNA的含量和种类;(2)比较针刺组治疗前后血清外泌体microRNA的表达差异;(3)比较等待治疗组4周前后血清外泌体microRNA的表达差异。根据上述3个比较层次,运用韦恩图筛选出KOA患者经针刺治疗后主要影响的血清外泌体microRNA。3、采用TargetScan和miRDB预测所筛选出的差异microRNA的靶基因,并进一步分析靶基因的功能及相关通路。探讨针刺对KOA患者血清外泌体microRNA的调控机制,以期对KOA的基础研究及临床防治提供新的方向和参考。结果:结果:1、基线资料分析KOA患者与健康受试者基线资料均衡,具有可比性(P>0.05)。针刺治疗组与等待治疗组患者基线资料均衡,具有可比性(P>0.05)。2、针刺治疗KOA患者的疗效分析结果:与治疗前相比,针刺治疗组针刺后的疼痛评分、关节功能评分、WOMAC总分下降(P<0.05);在4周前后,等待治疗组的疼痛、僵硬、关节功能评分和WOMAC总分差异无统计学意义(P>0.05);两组间对照,针刺治疗组的疼痛、关节功能评分和WOMAC总分均低于等待治疗组(P<0.05)。3、血清外泌体microRNA表达的研究结果:(1)与健康受试者相比,KOA患者血清外泌体中差异表达的microRNA共236个,其中上调表达的114个,下调表达的122个;(2)与入组0周相比,针刺治疗4周后有60个血清外泌体microRNA出现表达差异,其中上调表达的32个,下调表达的28个;(3)与入组0周相比,等待治疗组入组4周后差异表达的外泌体microRNA共110个,其中上调表达的59个,下调表达的51个;(4)经过上述三个层次的比较和筛选分析,最终确定针刺调控KOA患者血清外泌体microRNA最为显著的3个外泌体microRNA分别为hsa-miR-1228-5p、hsa-miR-1296-5p、hsa-miR-3168。4、hsa-miR-1228-5p、hsa-miR-1296-5p、hsa-miR-3168的生物信息学分析结果:(1)靶基因预测结果:共预测3个外泌体microRNA的靶基因73个。(2)靶基因功能富集分析结果:对3个外泌体microRNA的靶基因的功能分析发现其可能参与调节RNA代谢过程、调节含核碱基的化合物代谢过程、调节RNA聚合酶II转录、调节核酸模板转录、调节RNA生物合成等多个生物过程,发挥多种分子功能。(3)靶基因Pathway分析结果:3个外泌体microRNA的靶基因共富集了37条通路,包括细胞凋亡、细胞自噬、乙型肝炎、非小细胞肺癌、II型糖尿病、肥厚型心肌病、调节脂肪细胞中的脂肪分解等生化代谢途径,MAPK信号通路、p53信号通路、ErbB信号通路、催产素信号通路等信号转导途径。结论:1、针刺治疗可有效缓解KOA患者膝关节疼痛及关节功能活动;2、KOA患者与健康受试者血清外泌体microRNA的差异表达明显,其中上调表达的114个,下调表达的122个;3、针刺干预能下调KOA患者血清外泌体hsa-miR-1228-5p、hsa-miR-1296-5p、hsa-miR-3168的表达;4、通过对三个差异表达的血清外泌体microRNA进行生物信息学分析可知,针刺可能通过调控KOA患者MAPK信号通路、细胞凋亡、细胞自噬及代谢等途径,发挥治疗作用。