自噬（autophagy）是细胞利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质过程,是真核细胞特有的生命现象。自噬现象最早是Ashford和Porten于1962年用电子显微镜在人的肝细胞中观察到。但直到近10年,随着酵母模型的建立和基因技术的发展,人们对自噬分子机制和形态特点的了解才逐渐深入,并认识到自噬性细胞死亡有别于凋亡。凋亡又称Ⅰ型程序性细胞死亡（programmed cell death typeⅠ,Ⅰ型PCD）。在多细胞生物中,正是通过细胞凋亡机制,使正常机体内衰老、无用、损伤或有恶变潜能的细胞得以清除。细胞凋亡在维持组织、器官的正常形态和功能方面起着非常重要的作用。它将机体的组成成分限制在生理需要的范围之内。细胞凋亡与肿瘤的发生、发展以及治疗都有着非常密切的关系。细胞稳定状态的维持取决于细胞内大分子物质生物合成与代谢的平衡,这一平衡的打破往往导致肿瘤细胞生长或诱导细胞发生自我调节以适应环境。真核细胞存在两大主要的蛋白质降解途径——蛋白酶体和溶酶体途径。自噬作为溶酶体降解途径的形式之一,对于长寿命蛋白降解和细胞器更新发挥了必不可少的作用。正常发育过程中和外界环境压力刺激下都会诱导生物体自噬发生,细胞通过自噬获得可供生物合成的氨基酸及其它大分子物质,使之用于再循环;另一方面,自噬还会引起Ⅱ型程序性死亡（programmed cell death typeⅡ,Ⅱ型PCD）,作为分化、变态、衰老及转化进程中细胞重构的生理病理组成部分。肿瘤细胞的特点之一是逃逸凋亡,然而,近年来的研究提示肿瘤细胞能够以涉及自噬的非凋亡途径发生死亡。经药物处理后的肿瘤细胞可观察到自噬液泡数量的增加。雌激素受体拮抗剂他莫西芬处理乳腺癌细胞株McF27后,出现自噬液泡蓄积和细胞死亡,但几乎观察不到凋亡的改变,3-MA和雌二醇可抑制细胞死亡,说明他莫西芬诱导的自噬是一主动过程;同样,过氧化物酶体增殖因子活化受体C（peroxisome proliferator-activated receptor,PPAR C）配体作用的前列腺癌细胞也可观察到自噬性细胞死亡。PPARC能够上调抑癌基因PTEN在乳腺癌和结肠癌细胞中的表达,故PPARC配体可能通过PTEN调控自噬。其它药物如长春碱、三氧化二砷、雷帕霉素及维生素D衍生物亦能诱导肿瘤细胞自噬性死亡。Bcl-2和Bcl-xL依赖Beclinl明显增强凋亡刺激剂诱导的Bax/Bak^-/-MEFs自噬性死亡效应。然而,Saeki等发现反义下调Bcl-2蛋白可诱导人白血病细胞HL-60发生自噬性细胞死亡:Pattingre等进一步证实Bcl-2能够下调Beclinl依赖性自噬性细胞死亡。Bcl-2在不同的细胞中对自噬可能有不同的调控机制和效应。三氧化二砷（As₂O₃）作为一种抗肿瘤药物,主要机制是诱导肿瘤细胞凋亡,As₂O₃可诱导肿瘤细胞发生非凋亡形式的死亡,国内外已有很多研究报道。关于As₂O₃是否可诱导不同类型白血病细胞发生非凋亡形式的死亡（如自噬等）,国内外报道较少。我们设计观察不同浓度As₂O₃作用不同肿瘤细胞,包括肝癌HepG-2细胞,白血病HL-60细胞及白血病K562细胞,前后自噬水平的变化,探讨其发生机制,探讨它们之间的存在关系。并通过RT-PCR检测白血病细胞在不同浓度As₂O₃作用下Bcl-2 mRNA表达,从而发现Bcl-2对白血病细胞自噬的调控作用,对揭示白血病的发病机理,指导白血病的治疗将有重要意义。本博士学位论文共分为三部分,第一部分:三氧化二砷诱导肝癌细胞系HepG-2自噬及其机制研究;第二部分:三氧化二砷诱导白血病HL-60细胞自噬及与Bcl-2关系的研究;第三部分:三氧化二砷诱导白血病K562细胞自噬及与凋亡的关系研究;本研究主要目的、方法、结果和结论概述如下:研究目的:测定不同浓度三氧化二砷诱导HepG-2细胞自噬水平改变;测定不同浓度三氧化二砷诱导HL-60细胞自噬及与Bcl-2关系;测定不同浓度三氧化二砷诱导K562白血病细胞自噬;探讨自噬、凋亡及与Bcl-2之间的关系,探讨与白血病发生机制的关系,为揭示白血病的发病机制、为白血病靶向性药物及自噬基因的靶向治疗提供理论依据,以期为治愈白血病提供更好的方法。研究方法:1.细胞培养及分组:用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液置37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱培养。实验细胞以2×10⁵/ml接种于培养瓶中,行细胞爬片生长。待细胞贴壁后,分别加入不同浓度As₂O₃。按As₂O₃不同浓度分为5组:0uM/L,1.0uM/L,2.0uM/L,4.0uM/L,8uM/L;各组分别于药物处理24小时后用0.25%胰蛋白酶消化收获细胞或取出细胞爬片。2.细胞形态观察:分别于加药前后倒置显微镜观察,并摄片。3.MDC荧光染色检测自噬:自噬泡（autophagicvacuoles,AV）的染色:取出细胞爬片,PBS洗两次,除去含血清的培养基。用0.05 mmol/L MDC于37℃温育60 min后,4%多聚甲醛固定15 min,PBS洗两次,晾干后观察。使用荧光显微镜（Olympus）加用356 nm发射滤片和545 nm阻断滤片进行观察和摄片。4.自噬的流式细胞术（FCM）定量分析:以上述MDC染色方法染色,用Elite流式细胞仪（COULTER公司,USA）以488nm激发波长,测定MDC染色的荧光强度。将光散射及荧光数据存入计算机分析得出结果。5.凋亡的流式测定:收集1×10⁷细胞,PBS洗涤制成1×10⁶ cell·ml^-1的悬液,将细胞悬液滴入预冷（-20℃）的70%乙醇中固定,4℃过夜,次日洗去乙醇,用含有0.1%Triton-100,0.1 mmol·L^-1 EDTA 5μg·ml^-1 PI的PBS溶液染色,同时加入100 U·ml^-1的RNase,室温暗处孵育30 min,洗去PI,重新悬浮,染色后0.5 h内上机,用Cellquest Version1.2.2软件获取10 000个细胞并分析。6.RT-PCR检测bcl-2 mRNA表达:37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱培养24小时后,收集细胞,PBS洗两次。RNA的提取采用异硫氰酸胍一步提取法,260/280 nm测定其浓度和纯度;RT-PCR步骤参照逆转录酶试剂盒说明。PCR扩增所用引物序列如下:bcl-2:Sense 5’-TGTGGCCTTCTTTGAGTTCG-3’,Antisense 5’-TCACTTGTGGCTCAGATAGG-3’,片段280 bp;β-actin:Sense 5’-GGGTCAGAAGGATTCCTGTG-3’,Antisense5’-GGTCTCAAACATGATCTGGG -3’,片段317 bp。PCR产物各20μl,在10 g/L琼脂糖凝胶中电泳分离,溴化乙锭染色并在紫外灯下显影拍照。7.免疫组化法检测细胞Bcl-2蛋白阳性率:采用APAAP法,具体染色步骤参照试剂盒说明。阳性结果为胞浆内出现红色颗粒,油镜下计数100个细胞,并计算阳性细胞百分率。8.用透射电镜观察自噬、凋亡细胞变化。9.细胞形态学分析及核的变化:收集As₂O₃处理24h、48h的两种细胞,用相差显微镜观察并拍照。核的改变观察用70%冷乙醇将细胞固定于4℃过夜,PBS洗涤50g·ml^-1含0.1%Triton-100,0.1 M EDTA PI室温染色30 min,同时加入100 U·ml^-1的RNA酶,上流式细胞仪分析。10.统计处理:相关性分析采用Pearson直线相关分析。数据以x±s表示;两样本均数之间的比较,采用t检验。以上各种检验中,以0.05为显著性水平界值。采用SPSS10.0软件进行统计学分析。研究结果:1.As₂O₃对HepG-2、HL60、K562细胞的影响:显微镜下观测对照组细胞形态规则,成簇分布,细胞数目较多,胞质透明。经不同浓度As₂O₃作用24小时后,三种细胞数目显著减少,形态不舰则,细胞胞浆混浊。2.三种细胞自噬水平改变:自噬泡的本质是自噬溶酶体,MDC可染色于自噬特征性的自噬泡上而成为自噬的特异性染料。而荧光显微镜下所见肿瘤细胞MDC着染增强即为自噬泡积聚的表现。在各As₂O₃处理组,MDC阳性细胞数明显增加,每个细胞中自噬泡数量也较多。而对照组细胞,仅见到很少量的MDC阳性细胞,并且每个细胞中含的自噬泡数量也很少;流式细胞术定量测定各处理组MDC阳性细胞百分率随As₂O₃浓度增加而递增,与对照组比较,差异有统计学意义(分别P＜0.05,P＜0.01=。3.As₂O₃诱导凋亡:用流式细胞术测定K562细胞经不同浓度As₂O₃作用24h、48 h引起的凋亡比例。K562细胞在As₂O₃浓度低时的凋亡比例很低,只有当浓度很高时,才出现明显的凋亡。4.As₂O₃对Bcl-2蛋白表达及Bcl-2基因转录水平的影响:Bcl-2阳性反应产物呈棕黄色,主要位于细胞浆,染色强度强弱不一,分布也不规则。对照组及各处理组均可检测到Bcl-2蛋白表达,各处理组平均Bcl-2蛋白阳性细胞数随As₂O₃浓度上升而下降,且与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01=。5.细胞自噬同Bcl-2基因表达的关系:经相关性分析,细胞自噬水平与Bcl-2蛋白阳性细胞数呈负相关(r=-0.63,P＜0.05=。6.K562细胞自噬现象的透射电镜观察电镜下可见双层膜结构的自噬泡积聚及膨胀的线粒体。7.As₂O₃引起三种细胞形态和核的变化:As₂O₃作用24h后,电镜下出现细胞自噬的特征变化,可见双层膜结构的自噬泡积聚及膨胀的线粒体。As₂O₃作用48 h后,出现细胞凋亡的特征,可见细胞体积缩小,胞浆浓缩,胞核体积减小,可裂解成一个或数个致密体,可见核小体碎裂,核染色质聚集或边集,部分染色质致密成斑块状或沿核膜收缩成新月体状,整个细胞可裂解成大小不一的凋亡小体。研究结论:1.三氧化二砷可诱导HepG-2细胞、HL-60细胞及K562细胞自噬,机制可能与下调Bcl-2基因表达有关。2.As₂O₃对三种肿瘤细胞生长均有显著的抑制作用,且此作用呈明显的时间、剂量依赖性,随着浓度的增大自噬水平增高。3.MDC荧光染色和透射电镜结果均显示As₂O₃给药后可诱导三种肿瘤细胞发生自噬,且自噬泡的出现早于凋亡小体的出现。4.K562细胞在As₂O₃低浓度时,凋亡比例低,浓度增高时出现明显的凋亡。自噬在凋亡之前发生,自噬的激活延迟了凋亡的发生。研究意义:1.证实了三氧化二砷可诱导HepG-2细胞、HL-60细胞及K562细胞自噬,机制可能与下调Bcl-2基因表达有关。2.As₂O₃对三种肿瘤细胞生长均有显著的抑制作用,且呈明显的时间、剂量依赖性,随着浓度的增大自噬水平增高。3.自噬发生于凋亡之前,自噬的激活延迟了凋亡的发生。4.深入研究自噬与凋亡发生的机制与关系,将对揭示白血病的发病机制、为白血病靶向性药物及自噬基因的靶向治疗提供理论依据,为治愈白血病提供更好的方法。