第一部分基于iTRAQ2D LC-MS/MS技术筛选与鉴定肺结核病血清蛋白生物学标志物研究背景：结核病(Tuberculosis, TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)引起的一种严重危害人类健康的慢性呼吸道传染病,以肺结核病最为常见。结核分枝杆菌的致病性与细菌增殖引起的炎症反应、以及机体产生迟发型变态反应损伤相关。尽管直接观察与短程治疗(DOTS)战略的扩展及大量资金的投入,提高了治疗完成率,但疾病的诊断仍然是全球结核病控制的主要障碍,结核病仍是发病率和死亡率最高的感染性疾病之一。疾病的早期诊断和及时治疗对结核病的有效控制至关重要,是控制传染源,遏制结核病流行的最重要措施。延误诊断则导致疾病加重,增大死亡的风险,促进结核病的传播。目前临床上肺结核病的诊断方法有多种,但是鲜有改善结核病诊断的新技术,使得结核病诊断方法陈旧。机体感染结核分枝杆菌后,通过固有免疫和获得性免疫抵御病原菌,在相互作用过程中可能会引起宿主机体的病理生理改变,可以通过检测这种变化,寻找肺结核病的早期诊断方法。血清具有易获得、非侵入性、对疾病的反应快速等优点,是疾病生物学标志物的理想来源。本课题将应用iTRAQ标记结合2DLC-MS/MS技术筛选肺结核病与健康对照及肺部其他疾病血清中的差异表达蛋白,进一步应用ELISA方法验证差异表达蛋白,通过受试者工作曲线ROC分析潜在生物学标志物的准确性、灵敏性和特异性,为肺结核病的临床诊断提供有意义的实验数据。研究方法：本研究收集血清样本共160例,其中肺结核病组40例,健康对照组40例,鉴别诊断组(肺炎组40例,肺癌组40例)。应用iTRAQ2D LC-MS/MS技术分析肺结核病与健康对照及肺部其他疾病血清中的蛋白,并通过Proteinpilot软件鉴定与定量差异表达蛋白。应用生物信息学分析显著差异表达蛋白的细胞成分、分子功能和生物过程。应用ELISA方法验证差异表达的血清蛋白。应用受试者工作曲线对各个蛋白诊断肺结核病的灵敏性、特异性和准确性进行比较和分析。研究结果：本研究应用iTRAQ2D LC-MS/MS技术检测肺结核组与健康对照组及肺部其他疾病血清中的差异表达蛋白。在肺结核病血清中,共鉴定了434个蛋白质,筛选出34个蛋白(包括24个蛋白上调表达和10个蛋白下调表达)。经ELISA分析发现有3个显著差异表达的蛋白,即蛋白S100-A9(S100A9)、胞外超氧化物歧化酶(SOD3)和基质金属蛋白酶9(MMP9)。相关分析发现肺结核组中MMP9的血清浓度分别与SOD3(r=0.581). S100A9(r=0.471)中度相关,SOD3与S100A9弱相关(r=0.287)。应用受试者工作曲线分析,S100A9. SOD3和MMP9组合鉴别肺结核病与健康对照的灵敏性和特异性为92.5%和95%,鉴别肺结核病与肺炎的灵敏性和特异性为90%和87.5%,鉴别肺结核病与肺癌的灵敏性和特异性为85%和92.5%。结论：(1)建立iTRAQ2D LC-MS/MS结合ELISA检测技术的肺结核病血清蛋白检测技术平台；(2)筛选出了3个显著差异表达的蛋白,即S100A9、 SOD3和MMP9。 S100A9、 SOD3和MMP9组合鉴别肺结核与健康对照组及肺部其他疾病的灵敏性和特异性为85%和87.5%及以上,可以作为肺结核病的潜在生物学标志物,为肺结核病的临床诊断提供了实验依据。(3)筛选的其他显著差异的蛋白,如Sushi, nidogen and EGF-like domain-containing protein1(SNED1)、 L-lactate dehydrogenase A chain (LDHA)、 Filamin-A (FLNA)和Costars family protein C6orfll5(ABRACl)等由于研究背景、材料及商品化试剂盒的限制在本研究中没有被验证。对于这些蛋白的进一步研究可以帮助我们找到更多有效的肺结核病诊断标志物。第二部分FCN2基因单核苷酸多态性与肺结核病易感性的关联性研究研究背景：全球有三分之一的人群曾感染过结核分枝杆菌,约有5%-10%的人群最终发展成为活动性肺结核。本实验室以往的研究发现,基因单核苷酸多态性(SNPs)与结核病易感性存在相关性,提示遗传因素可能会影响个体对结核病的易感性。凝集素途径是补体激活的一个重要途径,在机体抵御病原菌感染过程中发挥重要作用。Ficolin-2凝集素是先天性免疫模式识别分子,能识别并结合多种病原菌,通过MBL-相关丝氨酸蛋白酶如MASP2激活补体途径,在病原菌表面标记C3b,促进巨噬细胞吞噬病原菌,形成膜攻击复合体并破坏其细胞膜,直接消灭病原菌。目前还没有FCN2基因SNPs与肺结核病相关性的研究。本研究将进一步探索FCN2基因启动子区和外显子8区的7个SNPs位点与中国汉族人群肺结核病的相关性,为预防和控制肺结核病提供新的思路。研究方法：应用PCR扩增和DNA测序技术,采用病例-对照方法,对中国汉族人群282例肺结核组和254例健康对照组血样的FCN2基因启动子区(-986G>A、-602G>A,-557A>G、-64A>C和-4A>G)和外显子8区(+6359C>T和+6424G>T)的7个SNPs位点基因型及等位基因频率分布进行检测。应用逻辑回归方法,在五种不同的遗传模式下(共显性、显性、隐性、超显性和加性)分析单个SNP与结核病的相关性。应用SNPstats及Haploview4.2软件对7个位点进行连锁不平衡分析。研究结果：研究发现FCN2基因7个SNPs位点的等位基因在肺结核组与健康对照组之间的分布频率没有显著性差异。然而,变异纯合基因型(P=O.037.-557A>G；P:0.038,-64A>C；P=O.024,+6424G>T)在肺结核病组的分布频率低于健康组,在两组之间存在显著性差异。经年龄和性别校正后,一557A>G(P=O.019:OR=0.24；95％CI,0.07一0.89),.64A>C(P=0.019；OR=0.24；95％CI,0.07-0.89)和+6424G>T(P=0.012；OR=0.23；95％CI,0.06.0.82)位点在隐性模式下与肺结核病存在显著相关性。另外,.64A>C(P=0.047)和+6424G>T(P=O.03)在共显性模式下与肺结核病也存在显著相关性。连锁不平衡分析发现,除-602G>A位点以外,其余6个位点之间均存在强连锁关系(D’＞0.75,P<0.0001)。另外,构建的单体型与肺结核病均不存在显著相关性。因此FCN2基因的.557A>G..64A>C和+6424G>T位点与肺结核病存在相关性,可能为肺结核病的保护性因素。结论：(1)采用病例-对照方法及统计学分析,首次对FCN2基因启动子区及外显子区8的7个SNPs位点与肺结核病的易感性进行关联研究。(2)FCN2基因的.557A>G、64A>C和+6424G>T位点的变异纯合型可能为肺结核病的保护性因素,在隐性模式下与肺结核病显著相关。-64A>C和+6424G>T位点在共显性模式下也与肺结核病显著相关。(3)FCN2基因的.986G>A、602G>A、-4A>G和+6359C>T的SNPs与中国南方汉族人群肺结核病均不存在显著的相关性。