研究背景和目的：恶性肿瘤是导致人类死亡的主要原因之一,不仅严重危害患者的身心健康,而且给家庭和社会带来沉重的经济负担。90%以上恶性肿瘤患者死于肿瘤的侵袭转移。目前临床主要依靠血清标志物和影像学手段来评估肿瘤复发转移转移和监测治疗疗效。由于大部分恶性肿瘤缺乏特异性和敏感性高的血清标志物,而影像学很难在转移早期检测到微小病灶,因此,需要其他诊断和检测方法以便提高肿瘤检出率和检测复发转移。肿瘤转移主要通过淋巴系统和血液循环两条途径,由于淋巴管不像血管具有交叉的内皮细胞紧密连接和周细胞,也没有用于贯穿的完整基底膜,更像一个盲端而非转移细胞的中转站,所以几乎所有远处转移都是通过血源性传播引起。目前认为,上皮来源恶性肿瘤细胞从原发病灶脱落,内渗进入血管形成外周血循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTCs),随着血液循环播散到远处器官,为恶性肿瘤复发复发转移奠定基础。肿瘤细胞入血是一个连续、不间断的过程,它可以在肿瘤原发灶很小甚至未形成前就出现在外周血中,而且CTCs来源于肿瘤病灶,其基因突变和蛋白变异与其原发肿瘤基本一致,可以直接反应肿瘤的生物学特性。因此,越来越多的研究工作转向探索CTCs的价值和开发检测方法。此外,由于确诊肿瘤的“金标准”——组织／细胞病理学存在标本取材困难,创伤性大,受患者身体条件限制,无法动态监测疾病进展等弊端,外周血CTCs检测作为一种无创、简便易行、可连续实施的活检方法具有重要应用前景。每毫升外周血通常含有1×107个白细胞和5×109个红细胞,相对于血细胞来说,存在于外周血中的肿瘤细胞数目非常少,称为稀有细胞。如何富集和鉴定外周血中的肿瘤细胞成为CTCs检测最大的技术障碍。为解决这个问题,近年来用于CTCs富集和鉴定技术得到快速发展。2004年美国食品和药品管理局(food and drugs admistration, FDA)批准了CellSearch系统用于检测转移性乳腺癌患者外周血CTCs,成为第一个获准进入临床运用的检测方法。CellSearch系统主要由免疫磁珠正性富集和免疫荧光鉴定肿瘤细胞的方法组成,即利用结合在磁珠上的抗上皮细胞分子标志EpCAM捕获外周血中异常存在的上皮来源细胞,在磁场作用下将之分离出来,再用抗角蛋白标志CK8/18/19-PE和细胞核DAPI染色而鉴定。CellSearch系统理论上适用于所有上皮来源恶性肿瘤CTCs的临床检测,但是实际上它并不适用于肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的CTCs富集。HCC是一种起源肝细胞的上皮恶性肿瘤,但上皮普遍标志EpCAM表达水平较低,仅为35%,而且目前认为EpCAM还可能是一种肝癌的肿瘤干细胞标志而非HCC的普遍标志。HCC是世界上最常见的癌症之一,由于其恶性程度高、预后不良,肝癌是恶性肿瘤第三大致死原因。我国集中了全世界约55%的新发病例,由于大部分HCC缺乏早期症状,患者诊断时往往已为中晚期。临床主要依靠a-甲胎蛋白(alpha-fetoprotein, AFP)和影像学诊断,如超声(ultrasonography, US)和计算机断层扫描(computed tomography, CT)来诊断肝癌及其复发转移转移。虽然AFP是目前公认的用于诊断HCC的血清标志,但临床约有30-40%的HCC患者外周血AFP水平不高。US和CT虽然能客观显示肿瘤的大小、形态和位置等信息,但很难检测到直径<1.0cm的微小病灶。因此,通过CTCs检测来提高HCC检出率和疗效检测有可能成为一种新的辅助诊疗方法。如上所述,目前美国、中国唯一获得批准的CTCs检测方法—-CellSearch系统并不适用于HCC的外周血CTCs检测。因而,本文旨在建立肝癌,尤其是HCC适用的外周血CTCs检测方法。此外,通过随访一例食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)病例,对其4年来病情进展、治疗经过和外周血CTCs数目变化的相关性分析,动态监测不同疾病进程外周血CTCs数目改变,结合血清学、影像学和治疗手段,探讨CTCs在上皮来源恶性肿瘤复发转移和疗效评估中的意义。复发转移方法：第一部分：通过文献调研,在细胞系上比较和选择HCC候选标志分子。如选择细胞角蛋白(cytokeratin, CK)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican3, GPC3)、唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor, ASGR)的两个亚结构蛋白ASGR1和ASGR2、肝细胞抗原(hepatocyte, Hep)和AFP等6种候选标志分子,用免疫荧光法分析它们在7种人肝癌细胞HepG2、Hep3B、Bel-7402、 Bel-7404、SMMC-7721、HuH-7、SK-HEP-1和1种永生化人肝细胞系HL-7702上的表达水平。综合候选标志分子表达率和荧光强度,选定表达率和荧光强度高的标志CK、ASGR1和GPC3作为鉴定肝癌CTCs的组合标志分子。为最大程度保留外周血中可能存在的CTCs,我们选择免疫磁珠负性富集(negative selection)策略去除大部分血细胞,再对剩下的所有有核细胞进行CTCs鉴定,即选择HCC组合标志+／白细胞标志CD45-/细胞核染色DAPI+的细胞被认为是HCC的CTCs。同时,验证该方法对HCC细胞的回收率。确定富集和鉴定HCC的CTCs方法后,并在临床样本中验证了该方法的特异性。此外,在肝癌细胞上分析了肝癌干细胞(liver caner stem cells, LCSCs)的相关标志分子,如EpCAM、CD90和CD133,积累了实验数据。第二部分：随访一例晚期低分化ESCC病例4年(2009年至2013年),动态监测其外周血CTCs改变。记录和对比不同病程和治疗前后外周血CTCs数目和形态改变与血清学和影像学检查,以及治疗方案和疗效的相关性,分析监测外周血CTCs改变在评估疾病进展和治疗疗效中的意义。结果：第一部分：免疫荧光染色结果显示,肝细胞普遍标记物CK.ASGR1、ASGR2在所有细胞系包括肝癌和正常肝细胞都表现(+)～(+++)荧光强度。Hep表现并不突出,大部分细胞系呈现弱阳性,甚至阴性。肝癌特异标志物GPC3在肝癌细胞表现为(+)～(+++)荧光强度,但正常肝细胞表现为(-)。HepG2、 Hep3B和HuH-7仍旧保持分泌AFP。CD45是造血细胞特异性标志物,所有肝细胞都表现为阴性。回收率实验显示免疫磁珠负性富集能捕获75%HCC细胞。我们选定CK、ASGR1和GPC3作为HCC CTCs鉴定标志物结合免疫磁珠负性富集。利用该方法我们成功在肝癌患者外周血中捕获并鉴定到CTCs,而未在正常人外周血找到CTC。肝癌干细胞数目很少,视野中一般只有几个甚至没有EpCAM、CD90或CD133阳性细胞,其余细胞则染色阴性。有的阳性细胞比周边细胞体积大,有的则呈分裂状态。第二部分：患者确诊为ESCC,病理分期：T3N2M0,临床分期：Ⅳ期。从2009年到2013年我们共监测患者术前术后、治疗前后CTCs13次：术前CEA正常,发现1个可疑CTC,无远处转移；术后CTCs数目激增到14个,之后出现转移病灶；虽然经放化疗,CEA保持正常,但CTCs数仍保持较高水平,患者之后出现肺转移；调整治疗方案后,CTCs出现凋亡数目增多,且总数逐渐下降；术后33个月,可见14个CTCs,2个月后复查CTCs仍有14个,行PET检查怀疑复发；再次调整治疗方案,复查CTC为零,患者病情稳定。期间CEA一直保持正常水平。结论：第一部分：在培养细胞上评估候选标志分子,确定CK、ASGR1和GPC3可用于肝癌细胞鉴定；利用免疫磁珠负性富集有效捕获到外周血HCC细胞；结合免疫磁珠负性富集和HCC标志荧光染色的方法可以在肝癌患者外周血中捕获并鉴定CTCs。部分HCC细胞上少量表达LCSCs标志物,且表达LCSCs的细胞多核大,呈分裂状。第二部分：随访1例ESCC患者4年来病情进展、治疗经过和CTCs变化,提示CTCs是监测复发复发转移和治疗效果的窗口,能较血清标志CEA和影像学检查更为敏感地反映上皮来源恶性肿瘤的病程变化和治疗疗效。主要创新点：1、在7个人肝癌细胞和1个体外培养人肝细胞上筛选和评估了7个HCC和3个肝癌干细胞候选标志分子,获得表达率和荧光强度高的CK、ASGRl和GPC3作为鉴定肝癌CTCs的组合标志分子。2、初步建立了HCC外周血免疫磁珠负性富集和鉴定方法,即选择HCC组合标志+／白细胞标志CD45-/细胞核染色DAPI+的细胞被认为是HCC的CTCs。3、动态监测外周血CTCs数目和形态改变,随访低分化ESCC病例4年,提示CTCs是监测复发转移和治疗效果的窗口,能较血清标志和影像学检查更为敏感地反映上皮来源恶性肿瘤的病程变化和治疗疗效。