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目的及意义：最初基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)被描述为细胞外基质基板，后因其结构和功能特性定义为一类酶家族。其主要分为三类：胶原酶；明胶酶和基质溶解酶。大量研究表明，胶原酶存在于牙周炎患者的唾液和组织中，并随着炎症程度加重而增加，其中最为显著的是MMP-2，牙周炎经过有效治疗MMP-2表达明显降低。但对于靶向调控MMP-2上游位点还未见报道，目前随着miRNAs的发现和发展，为牙周炎的研究开辟了新的思路。miRNAs是由21～24核苷酸所组成并且存在于真核细胞当中的一个非编码小分子RNA，通过抑制蛋白的转录和翻译来调节细胞行为。miRNAs不仅在细胞凋亡、迁移、增殖、分化等生理过程中发挥作用，也与炎症疾病的发生发展有密切关系。研究表明，miRNAs具有炎症负反馈调节机制，如在牛皮癣患者中观察到miR-181b可以通过抑制核因子NF-ΚB表达来调节炎症反应，同时炎症性刺激也可减少miR-181b的表达。作为机体内源性小RNA，miRNAs很可能在牙周炎发生发展中起到重要的调控作用。牙周膜细胞(peridontal ligament cells，PDLCs)是由Arnold发现的，其来源于牙周组织，是牙周结缔组织的主要间质细胞，在牙周组织的形成和再生过程中起着关键作用，PDLCs的增殖和分化在组织再生和修复过程中起重要作用，而PDLCs的凋亡是牙周破坏和修复的重要病理生理过程。我们假设miRNAs可通过调控MMP-2的表达影响牙周炎的发生发展。实验通过生物学信息方法预测可调控MMP-2的miRNAs，并用qRT-PCR和Westernblot验证在牙周膜细胞中miRNA对MMP-2mRNA和蛋白表达的调控关系，用双荧光素酶验证miRNA是否作用于MMP-23’UTR的靶位点。研究方法及步骤：1、生物学信息检测：通过DIANA-microT；TargetScan和miRanda；PITA四种在线预测软件预测可能靶向于MMP-23’UTR的miRNAs，以四个预测软件综合结果和总分靠前为原则。2、人PDLCs培养与鉴定：在重庆第三军医大学新桥医院口腔科门诊采集因正畸需要拔除的健康、无龋坏的上颌前磨牙，用酶消化组织块法分离细胞并常规培养；倒置相差显微镜下观察细胞生长状态及其变化；取第2代细胞进行免疫组化法检测细胞表型。3、验证miRNAs对MMP-2调控： PDLCs被mimics-miRNAs和miRNAs negativecontrol(对照组)转染后，通过qRT-PCR和Western blot检测细胞中MMP-2mRNA和western blot表达的改变，通过双荧光素酶验证基因的靶点，MMP-2野生型及突变型质粒与miRNA模拟物和miRNA抑制剂共同转染于PDLCs中，negative control与报告质粒共转染做阴性对照，以GV272为空白对照。研究结果：1、通过在线预测软件TargetScan；DIANA-microT；miRanda和PITA预测可能靶向于MMP-23’UTR的miRNAs，综合四个软件不同的算法预测出miR-520h；miR-520g；miR-519d-3p；miR-519c-3p；miR-519d五个miRNAs可能靶向于MMP-23’UTR。2、连续培养的人PDLCs增殖快，细胞呈集落状生长，单个细胞可见2～4个细胞突起；免疫组化法检测细胞抗角蛋白阴性，抗波形丝蛋白阳性。3、人牙周膜细胞转染mimics-miRNAs后可观察到miRNA的表达量与对照组相比明显上升(P＜0.01)。人牙周膜细胞转染miR-520h-mimics；miR-520g-mimics；miR-519d-3p-mimics；miR-519c-3p-mimics能明显抑制MMP-2mRNA和蛋白的表达水平(P＜0.05)。但转染miR-519d-mimics后并没有引起MMP-2mRNA和蛋白表达的变化(P>0.05)。 miR-520h-mimics； miR-520g-mimics； miR-519d-3p-mimics；miR-519c-3p-mimics分别和野生型MMP-2共转染PDLCs中可引起荧光素酶活性下降(P<0.05)，突变型转染组荧光素酶活性无明显变化。miR-519d-mimics和MMP-2野生型质粒转染入细胞没有使荧光素酶活性产生变化，与PCR和Western结果一致(P<0.05)。结论：1、通过miRNAs预测软件的综合结果预测到5种miRNAs：miR-520h、miR-520g、miR-519b-3p、miR-519c-3p、miR-519d可负性调控MMP-2的表达。2、人牙周膜细胞被miR-mimics组转染后，其miR-520h、miR-520g、miR-519b-3p、miR-519c-3p、miR-519d呈高表达。3、在牙周膜细胞中miR-520h；miR-520g；miR-519b-3p；miR-519c-3p显著下调MMP-2mRNA和蛋白的表达水平；并且这些miRNA对MMP-2表达的调控是通过直接与MMP-23’UTR序列互补配对，抑制MMP-2mRNA翻译实现的。