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背景:帕金森病(Parkinsons disease,PD)是一种常见的年龄相关、呈进行性发展的神经系统变性疾病,其发病机制目前尚不清楚。近年来越来越多研究显示表观遗传修饰异常与疾病的发生发展密切相关,神经退行性疾病中也已有许多报道DNA甲基化等表观遗传改变参与甚至决定发病进程。明确帕金森病病因及其发病机制,寻找切实有效的治疗手段,成为医学界亟待解决的问题。 目的:通过神经毒素MPP+诱导氧化应激损伤SH-SY5Y构建PD细胞模型,1)探究DNA甲基化酶(DNMT1、DNMT3A、DNMT3B)和甲基化CpG结合蛋白(如MBD2)的表达情况以及可能的调控机制;2)检测PD致病相关基因的甲基化水平和mRNA转录表达水平。探讨DNA甲基化在帕金森病发病机制中所起的作用。 方法: 1.MPP+诱导的SH-SYSY细胞中DNMT1、DNMT3A、DNMT3B和MBD2的表达变化。 1.1 取对数生长期的SH-SY5Y细胞,设正常对照组和0.1mmol/L、0.25mmol/L、0.5mmol/L和1mmol/L4个MPP+浓度组,药物处理后继续培养24h,用Western Blotting方法检测MPP+诱导损伤后的SH-SY5Y细胞DNMT1、DNMT3A、DNMT3B和MBD2的表达变化。 1.2 取对数生长期的SH-SY5Y细胞,选用1mmol/L MPP+,处理后分别培养0,6,12,24h,用Western Blotting方法检测DNMT1、DNMT3A、DNMT3B和MBD2的表达变化。 2.MPP+、抗氧化剂NAC以及两者联合处理SH-SY5Y细胞后ROS水平的变化以及DNMT1和DNMT3A水平的变化。 取对数生长期的SH-SY5Y细胞,设阴性对照组(空白组)、MPP+(1mmol/L)组、NAC组和NAC+MPP+(1mmol/L)组共4组,处理24h后,(1)用ROS敏感性荧光探针(DCF)测定ROS水平对活力;(2)用Western Blotting方法检测DNMT1和DNMT3A的表达变化。 3.MPP+、抗氧化剂NAC以及两者联合处理SH-SY5Y细胞后SNCA的甲基化水平和转录表达水平。 取对数生长期的SH-SY5Y细胞,设阴性对照组(空白组)、MPP+(1mmol/L)组、NAC组和NAC+MPP+(1mmol/L)组共4组,处理36h后,(1)用亚硫酸氢盐测序PCR(BSP)测定SNCA的甲基化水平;(2)用RT-qPCR方法检测方法检SNCA的mRNA水平。 结果: 1.MPP+导致DNMT1和DNMT3A的下降呈时间、剂量依赖性。 用MPP+浓度分别为0.1,0.25,0.5和1.0mmol/L处理SH-SY5Y24小时可以导致DNMT1和DNMT3A呈现剂量依赖的下降,而DNMT3B和MBD2则没有明显的变化;当选用1.0mmol/L MPP+处理SH-SY5Y分别为0,6,12,24小时,DNMT1和DNMT3A的下降呈现出时间依赖性。 2.NAC预处理可以逆转MPP+处理SH-SY5Y导致的DNMT1和DNMT3A的下降。 选用1.0mmol/L MPP+处理SH-SY5Y24小时可以导致ROS水平明显升高,而用4mmol/L NAC预处理SH-SY5Y1小时,可以使ROS水平基本恢复至正常水平;而相应的,NAC预处理使DNMT1完全回复至原有水平,DNMT3A部分回复至原有水平。 3.MPP+可以导致SNCA1号内含子区的CpG岛去甲基化,而NAC预处理则可使甲基化水平恢复至原有水平。 CpG岛预测软件分析发现SNCA基因有两个CpG岛:分别位于启动子区(CpG-1)和1号内含子区(CpG-2)。亚硫酸氢盐测序PCR发现:MPP+处理SH-SY5Y24小时使CpG-2的23个CpG位点甲基化水平明显下降:13.0±4.3%(MPP+组)VS30.4±7.2%(对照组),而CpG-1的甲基化水平没有明显改变。NAC预处理显著逆转MPP+诱导的甲基化水平下降:25.7±11.6%(MPP+组)VS13.0±4.3%(NAC+MPP+组)。进一步分析CpG-2的单个CpG位点发现:除外第1、2、3、5、8、13和15 CpG位点,其他所有CpG位点在MPP+处理均发生了去甲基化;另外,除外第4、20和23CpG位点,NAC预处理使所有发生去甲基化的位点都有不同程度地恢复至原始水平。 4.SNCA1号内含子区的CpG岛甲基化状态直接调控α-核突触蛋白的表达。 MPP+处理使SNCA mRNA水平显著升高,而NAC预处理显著逆转MPP+的作用。SNCA mRNA水平与SNCA1号内含子区的CpG岛甲基化状态基本一致。 结论: 1.在MPP+诱导氧化应激损伤SH-SY5Y构建的PD细胞模型中,DNA甲基化酶(DNMT1和DNMT3A)表达降低。提示异常DNA甲基化与PD相关。 2.ROS水平能够调控DNMT1和DNMT3A的表达。表明在PD中,氧化应激可能作为DNA甲基化酶异常的上游通路。 3.SNCA1号内含子区的CpG岛甲基化状态直接调控α-核突触蛋白的表达。提示SNCA可能作为PD异常DNA甲基化的靶基因。