目的:1研究盆腔器官脱垂患者骶韧带组织中CollagenI、Wnt/β-catenin信号通路的表达。2研究机械力对原代培养的骶韧带成纤维细胞中Wnt/β-catenin信号通路及分泌CollagenI能力的影响。3研究机械力对成纤维细胞分泌MMP-1的影响。4从信号通路水平研究机械力在盆腔器官脱垂发病机制中的作用。方法:1研究对象选取2016年6月-2016年9月在河北医科大学第二医院东院妇二科因盆腔器官脱垂(Pelvic organ proplase,POP)行手术治疗患者的骶韧带为病变组,同期因子宫良性病变行腹腔镜下全子宫切除术患者的骶韧带组织为对照组。两组患者均无子宫内膜异位症、慢性阻塞性肺气肿、类风湿性关节炎等与结缔组织相关的疾病,术前3个月内均未使用过性激素治疗。病例组及对照组在年龄、孕产次、体重指数等方面比较,差异均无统计学意义(P>0.05)(Table 1)。2取材所有患者签署知情同意书。所取标本由一位副主任及以上级别的医师在腹腔镜下取得近宫颈部分的骶韧带组织,其中非POP患者的骶韧带组织一部分至于无血清的DMEM高糖无菌培养基内,4°C冰盒送往实验室,进行细胞原代培养,且整个取材及运输过程小于1小时并要求严格无菌;一部分至于4%福尔马林固定液内,用于包埋、切片,还有一部分置于标本袋内于-80°C保存,用于组织蛋白的提取。POP患者的骶韧带组织一部分置于4%福尔马林固定液内,用于包埋、切片,另一部分置于标本袋内于-80°C保存,用于组织蛋白的提取。3免疫组织化学采用SP三步法对切片进行免疫组织化学染色,观察病例组与对照组中wnt16、β-catenin、collageni的表达。4通过westernblot检测pop组与非pop组骶韧带组织中wnt16、β-catenin、collageni的表达水平,所得数据采用spassibm21.0进行统计学分析,p<0.05认为差异具有统计学意义。5成纤维细胞原代培养与鉴定采用组织块法进行骶韧带成纤维细胞原代培养,通过倒置相差显微镜进行细胞形态学观察,免疫细胞化学进行细胞鉴定。6细胞力学实验采用flexcercell4000柔性基底拉伸加载系统对第3-5代处于对数期生长的骶韧带成纤维细胞进行加力,整个加载过程在二氧化碳培养箱内进行。加载参数:幅度15%,正弦波,0.5hz,加载时间分别为:0、6、12小时,在激光共聚焦显微镜下观察机械力加载后成纤维细胞的形态学变化,同时采用westernblot检测受力前后成纤维细胞中wnt16、β-catenin、collageni表达含量的变化。所得数据采用spassibm21.0进行统计学分析,p<0.05认为差异具有统计学意义。7采用elisa实验方法检测机械力加载对成纤维细胞分泌mmp-1的影响,所得数据采用spassibm21.0进行统计学分析,p<0.05认为差异具有统计学意义。结果:1免疫组织化学染色结果显示在病例组骶韧带组织中wnt16、β-catenin、collageni的表达较对照组均有明显的下降趋势。2通过westernblot检测组织蛋白中wnt16、β-catenin、collageni的表达,发现病例组中三者的表达水平较对照组均降低,且差异具有统计学意义。3原代培养第5天,组织块周围可见少量细胞爬出,细胞形态各异,但以梭形细胞为主;第10天,组织块周围爬出的细胞明显增多,呈放射状围绕于组织块周围,且以梭形细胞为主,亦可见三角形及多角形细胞;第20天,细胞较前增多且密集,绝大多数为梭形细胞,形态规则,但无明显的排列方向。免疫细胞化学染色,波形蛋白(vimentin)阳性,胞浆呈棕黄色,胞核呈蓝色,角蛋白(cytokeratin)和平滑肌肌动蛋白(α-sma)染色阴性,提示为成纤维细胞。4在机械力作用下骶韧带成纤维细胞的形态及生长方向发生变化,拉伸前,细胞呈多角形及梭形,无明显的排列方向,拉伸后,细胞细长,呈长梭形,生长方向一致,与最大应力方向垂直,且细胞间隙增大。5 Western blot结果显示在机械力加载6小时后Wnt16、β-catenin、CollagenI的表达量明显降低,且与0小时相比,差异具有统计学意义,当机械力加载12小时,三者的表达量均升高,但与0小时相比仍表现为下降趋势,且差异具有统计学意义。三者的升高与降低呈正相关。6 Elisa结果显示机械力加载成纤维细胞6、12h后,成纤维细胞分泌MMP-1的量明显增加,且与未加力培养6、12h的成纤维细胞分泌的MMP-1的量相比较,差异具有统计学意义。机械力加载后成纤维细胞分泌MMP-1的速度明显加快。结论:1 Wnt/β-catenin信号通路受抑制可能参与POP的发生、发展。2 Wnt/β-catenin信号通路能够调控成纤维细胞分泌CollagenI的能力。3一定程度的机械力能够抑制Wnt/β-catenin信号通路,其抑制程度可能与机械力作用时间有关。4一定程度的机械力能够促进成纤维细胞对MMP-1的分泌。