第一部分慢性乙型肝炎患者甲基CpG结合结构域家族成员的研究研究背景乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)感染呈全球性流行。目前,全球慢性HBV感染患者大约有2.4亿,其中每年因此病致死的人数多达65万。慢性HBV感染是由HBV复制与宿主免疫应答协同作用而构建的动态过程。研究表明,表观遗传学调控尤其是DNA甲基化参与慢性HBV感染的过程,并在慢性HBV感染患者的结局中发挥重要作用。甲基CpG结合结构域(methyl-CpG binding domain,MBD)家族蛋白作为表观遗传学中DNA甲基化的"读出器",能够识别基因组中CpG岛上甲基化的胞嘧啶残基,募集协同抑制因子,从而调控基因表达。此外,MBD蛋白的转录抑制作用也体现在染色质重构与组蛋白修饰的相互串扰中。MBD家族主要成员独特的表观遗传学修饰功能,使得它们在肿瘤发生中可能的作用与机制也被学者所揭示。而最近的研究同时观察到了 MBD家族主要成员在自身免疫性疾病,如系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)与类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)等疾病中的变化。然而,慢性HBV感染过程中,MBD家族成员是否存在变化,能否在疾病进展中发挥表观遗传学调控作用,却仍未被阐明。目的本研究旨在测定慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者MBD家族主要成员的变化,评估其在CHB病情进展中可能的作用与联系。研究方法本研究纳入369例CHB患者与14例正常对照(healthy controls,HCs)人群。369例CHB患者是2014年6月-2016年8月于山东大学齐鲁医院肝病科收集的。研究组中223例CHB患者是2014年6月-2015年10月收集的,由20例免疫耐受(immune tolerant,IT)期、69例免疫清除(immune clearance,IC)期、103例低(非)复制期(non/low-replicative,LR)期与31 例再活动(HBeAg negative hepatitis,ENH)期患者所构成。验证组中146例CHB患者是2015年11月-2016年8月收集的,由16例IT期、44例IC期、67例LR期与19例ENH期患者所构成。所有CHB患者中共有40例接受肝穿刺组织病理学检查,其中研究组有34例,而验证组仅6例。谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)与血小板(platelet,PLT)比率指数(AST-to-PLT ratio index,APRI)积分被用于CHB患者肝脏纤维化程度的评估。CHB与HCs外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中MBD家族主要成员mRNA的表达情况通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)法测。结果1.CHB患者PBMCs中MeCP2、MBD1、MBD2以及MBD4mRNA水平均高于HCs。但是,CHB患者与HCs的MBD3 mRNA水平无统计学差异。2.CHB患者中MBD家族主要成员mRNA与病情严重程度的联系:CHB患者MBD2 mRNA水平与血清谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)水平间呈正相关(r=0.151,P=0.028),MBD4 mRNA水平与血清ALT(r=0.18,P=0.008)、AST水平(r=0.208,P=0.003)间分别呈正相关。然而,MBD家族其他成员与肝功能指标间并无统计学联系。3.研究组中,HBeAg阳性患者HBV DNA均为阳性,且此类患者的MBD2与MBD4mRNA相较阴性患者高表达。而HBeAg阴性患者则是由HBV DNA阳性患者(组a)与阴性患者(组b)组成。我们观察到组a患者PBMCs中MBD2、MBD3、MBD4 mRNA相较组b却为低表达。4.CHB患者不同免疫分期间比较:CHB患者4个免疫分期PBMCs中MeCP2、MBD1与MBD2mRNA水平均高于HCs。其中,MBD1mRNA水平为IT期显著高于其他3期;MBD2与MBD4 mRNA水平则为IC期显著高于其他3期。MBD3 mRNA水平却是仅IC期高于HCs。MBD4 mRNA水平是除ENH期外,IT、IC与LR期均高于HCs,同时LR期高于ENH期。但是,MeCP2与MBD3 mRNA水平在4个免疫分期间差异无统计学意义。5.MBD1 mRNA对IT期的预测价值:双变量logistic回归表明研究组中MBD1 mRNA与IT期密切相关。受试者工作特征(receiver operating characteristics,ROC)曲线显示,MBD1 mRNA预测IT期的曲线下面积(area under the curve of ROC,AUC)为0.732(P<0.001),最佳截断值为0.0305,灵敏度75%,特异性65.52%。验证组中则发现,MBD1 mRNA预测IT期的AUC为0.704(P=0.001),最佳截断值是0.0305,灵敏度与特异性分别是81.25%与61.54%。6.MBD2与MBD4 mRNA对IC期的预测价值:MBD2与MBD4 mRNA均与IC期密切相关。研究组中,二者预测IC期的AUC分别是0.671(P<0.001)和0.716(P<0.001),但AUC间统计无意义。MBD2mRNA的最佳截断值为0.0069,而MBD4 mRNA的最佳截断值为0.00099。它们的灵敏度、特异性分别是85.51%、44.81%与63.77%、75.97%。双变量logistic回归拟合MBD2与MBD4 mRNA联合变量公式是:参数(MBD2联合MBD4)=50.591×MBD2+555.483×MBD4-2.314。ROC曲线分析发现,联合变量预测IC期的AUC是0.736(P<0.001),最佳截断值是-0.841,灵敏度68.12%,特异性69.48%。而且联合变量对IC期的预测价值明显优于MBD2mRNA(P=0.0225)。验证组中,MBD2与MBD4mRNA预测 IC期的AUC分别为0.665(P<0.001)和0.741(P<0.001)。对应的最佳截断值、灵敏度、特异性分别是0.0069与0.00099、86.36%与70.45%、42.16%与71.57%。而联合变量的AUC则是0.754,显著高于MBD2 mRNA(P=0.004)其最佳截断值是-0.841,灵敏度与特异度是70.45%与70.59%。7.CHB患者不同肝脏纤维化与炎症分期下MBD家族主要成员mRNA表达的变化:研究组中,S3+S4期患者MeCP2mRNA水平均高于S0-S2期患者。此外,不同肝脏炎症分级下MBD家族主要成员中仅MBD2 mRNA水平在G2期是显著低于G1和G3+G4期。但其他MBD家族成员mRNA在不同肝脏纤维化分级与炎症分期下表达并无不同。8.MeCP2 mRNA表达对CHB患者肝脏纤维化不同程度的预测意义:MeCP2 mRNA表达与肝脏纤维化程度间有着统计学相关。当S≥2归为重度纤维化时,MeCP2 mRNA与APRI积分均可预测S≥2纤维化(AUC 0.761 VS 0.716,P=0.707)。而将S3+S4归为重度纤维化时,MeCP2 mRNA对其的预测价值优于APRI积分(AUC 0.958 VS 0.717,P=0.0342),MeCP2 mRNA最佳截断值是0.0068,灵敏度100%,特异性85.19%。同时,MeCP2 mRNA对S4期纤维化的预测价值也优于APRI积分(AUC 0.946 VS 0.677,P=0.0424),其最佳截断值是0.0084,灵敏度与特异性则是100%与90.32%。这说明,MeCP2 mRNA可以很好的预测反映S3+S4以及S4期纤维化。9.CHB患者MBD家族成员mRNA的相关性分析:Spearman相关分析说明,CHB 患者 PBMCs 中 MeCP2 与 MBD2(r=0.243,P<0.001)、MBD1 与 MBD3(r=0.132,P=0.049)、MBD2与MBD3(r=0.209,P=0.002)的mRNA间都有正相关联系。提示,CHB患者MBD家族主要成员间存在密切联系。结论1.CHB患者PBMCs中MBD家族主要成员mRNA表达异常。2.PBMCs中MBD1 mRNA的表达对CHB中IT期患者有着很好的预测价值。3.PBMCs中MBD2与MBD4mRNA对CHB中IC期患者有着很好的预测价值,而且MBD2与MBD4 mRNA的联合变量对IC期的预测价值明显优于MBD2 mRNA。4.PBMCs中MeCP2 mRNA的表达可以反映CHB患者肝脏纤维化的程度。5.MBD家族主要成员参与CHB的发病过程并与疾病进展间关系密切,提示其在评估CHB病情严重程度中的具有较好预测价值。第二部分慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者甲基CpG结合结构域家族成员的研究研究背景慢性乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)感染包括慢性HBV携带者、慢性乙型肝炎(chronichepatitisB,CHB)、隐匿性CHB、乙型肝炎肝硬化、慢加急性乙型肝炎肝衰竭(acute-on-chronic hepatitis B liver failure,ACHBLF)等等。所有慢性HBV感染中病情最为凶险、短期死亡率最高的当属ACHBLF。该病在短期内出现的肝功能恶化衰竭基于患者原有慢性肝病之上。而在我国,约有八成慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure,ACLF)患者存在基础的慢性HBV感染,他们即为ACBHLF患者。ACHBLF病情进展迅速、短期死亡率高达85%。时至今日,ACHBLF的治疗依旧面临巨大挑战。严重肝脏疾病患者在病情发展过程中可能会进入肝衰竭(liver failure,LF),即为LF倾向患者。同时,部分ACHBLF患者病情进展迅速,但是在疾病初始阶段表现并不明显。密切监测与早期干预这些可能会进展为ACHBLF或者难治性ACHBLF的患者可能会降低其发病率与死亡率。所以,早期准确预测ACHBLF极其重要而且尤为迫切。越来越多的学者观察到,表观遗传学修饰介入到了 ACHBLF患者的发病之中。先前学者已陆续发现了 MBD家族成员在肿瘤发生、自身免疫性疾病中的功能。我们之前也报道了MBD家族主要成员在CHB患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中表达的改变,而且其改变提示MBD家族主要成员在评估CHB病情严重程度中具有较好的预测价值。ACHBLF与CHB之间存在显著不同,它是从慢性感染向爆发性状态转变的。所以,研究MBD家族在ACHBLF中的作用依旧有重要意义。目的本研究旨在测定ACHBLF患者MBD家族主要成员的变化,探讨MBD家族主要成员在疾病进展中的作用,评估其对ACHBLF患者病情预后中可能的预测价值。研究方法本研究纳入于山东大学齐鲁医院肝病科收治的142例ACHBLF患者与80例CHB患者。ACHBLF患者被分为研究组与验证组,包含研究组92例,是2012年4月-2015年2月收治的患者;验证组50例,是2015年3月-2016年5月收治的患者。终末期肝病模型(model for end-stage liver disease,MELD)积分用于ACHBLF患者的病情评估。30例健康志愿者从山东大学临床医学院募集,归为正常对照组(healthy controls,HCs)。所有研究对象PBMCs中MBD家族主要成员mRNA的表达情况通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)法测定。结果1.ACHBLF患者血清白蛋白(albumin,ALB)和凝血酶原活动度(prothrombin activity,PTA)低于CHB和HCs。相反,血清谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、总胆红素(total bilirubin,TBIL、国际标准化比值(international normalized ratio,INR)则高于CHB和HCs。在研究与验证组中,死亡组人群均具有较低的PTA和ALB,较高INR、TBIL和MELD积分以及肝性脑病(hepatic encephalopathy,HE)、腹水、自发性细菌性腹膜炎(spontaneous bacterial peritonitis,SBP)的发生率。2.MBD家族主要成员mRNA水平的变化:Kruskal-Wallis检验发现ACHBLF患者MBD1和MBD2 mRNA表达均较CHB和HCs上调。相反,ACHBLF患者MBD4 mRNA表达却明显低于CHB患者,但高于HCs。此外,ACHBLF患者MeCP2 mRNA表达亦高于HCs。与HCs相比,CHB患者MeCP2、MBD1、MBD2和MBD4 mRNA表达均增多。此外,死亡组患者较存活组患者MBD1和MBD2 mRNA水平明显升高,而MBD4 mRNA水平则显著减低。但两组人群在MeCP2和MBD3的mRNA表达上并无不同。3.ACHBLF患者MBD家族主要成员mRNA水平与临床指标的联系:研究组中,MBD4mRNA水平与PTA间存在正相关联系,而与TBIL、INR和MELD积分间则存在负相关联系。但其他MBD家族成员mRNA水平与临床指标间并无统计学相关。Spearman相关分析MBD家族成员间的相关性,发现ACHBLF患者MeCP2与MBD2(r=0.292,P=0.0055,MBD1与与MBD3(r=0.481,P<0.00)mRNA间都有正相关联系。4.MBD4 mRNA是ACHBLF患者预后的独立危险因素:Cox比例风险回归模型表明MELD积分、HE和MBD4 mRNA都是ACHBLF患者预后的独立危险因素。5.研究组中,MBD4 mRNA表达对ACHBLF患者死亡率的预测价值:MBD4 mRNA预测ACHBLF患者1月死亡率的曲线下面积(area under the curve of receiver operating characteristics,AUC)为0.907,显著高于MELD积分(0.714,P=0.0291)。说明MBD4 mRNA是一个比MELD积分更好的预测1月死亡率的指标。MBD4mRNA和MELD积分的最佳临界值分别为0.0005365和21.87,灵敏度与特异性分别为83.33%、92.86%与72.22%、76.69%。研究组按照最佳截断值分组以比较组间的生存率。Log-rank分析发现,MBD4mRNA≤0.0005365、MELD积分≥21.87的患者生存率较低,存活时间较短。MBD4 mRNA与MELD积分预测ACHBLF患者2月死亡率的AUC分别为0.816和0.811,最佳截断值为0.0005469和21.87,敏感度68.09%、93.33%,特异性68.09%、84.44%。Log-rank分析发现MBD4 mRNA≤0.0005469、MELD积分≥21.87的患者生存率较低,存活时间均较短。MBD4 mRNA与MELD积分预测ACHBLF患者3月死亡率的的AUC分别为0.762和0.847,最佳截断值为0.0005469和21.55,敏感度62.75%、92.68%,特异性72.55%、87.8%。MBD4mRNA≤0.0005469、MELD积分≥21.55的患者生存率较低,存活时间较短。然而,它们在对患者2月与3月死亡率的预测判断上没有差异存在。6.MBD4 mRNA表达对ACHBLF患者死亡率预测价值的验证:验证组PBMCs中MBD4 mRNA表达对ACHBLF患者1月死亡率的预测价值明显优于MELD积分(0.939 VS 0.762,P=0.035)。MBD4 mRNA≤0.0005365、MELD积分≥21.87的患者具有较低的生存率与较短的存活时间。在预测ACBHLF患者2月死亡率、3月死亡率上,两指标间无统计学差异(0.843 VS 0.834,P=0.998)(0.787 VS 0.836,P=0.5037)。在对患者2月死亡率的预测中,MBD4mRNA≤0.0005469、MELD积分≥21.87的患者具有较低的生存率与较短的存活时间。而在3月死亡率的预测中,MBD4mRNA≤0.0005469、MELD积分≥21.55的患者具有较低的生存率以及较短的存活时间。结论1.ACHBLF患者PBMCs中MBD家族主要成员mRNA表达异常。2.PBMCs中MBD4mRNA表达可预测ACHBLF患者1、2、3月死亡率。重要的是,相较MELD积分,PBMCs中MBD4mRNA对ACHBLF患者1月死亡率的预测价值更高。3.ACHBLF患者PBMCs中MBD4 mRNA表达可作为一个非侵入性的预测疾病严重程度及早期预后的生物学标志物。