【摘 要】
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本文综合利用了多学科的方法和技术,对纳豆激酶(Nattokinase,NK)的结构和功能进行了研究。首先利用生物信息学的技术,分析了NK的aprN基因,发现NK是由信号肽、前导肽和成熟肽
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本文综合利用了多学科的方法和技术,对纳豆激酶(Nattokinase,NK)的结构和功能进行了研究。首先利用生物信息学的技术,分析了NK的aprN基因,发现NK是由信号肽、前导肽和成熟肽序列构成。aprN基因的热动力学研究发现,NK的热动力学稳定,非常适合进行分子生物学的研究。分析NK的全氨基酸序列发现,在7~29个氨基酸序列区域,亲水性打分和疏水性打分都呈连续性分布,可见此区域定是NK的信号肽区域。根据NK的氨基酸序列,预测了它的二级结构以及三级结构。并利用同源模建技术,构建了NK分子的三维空间结构模型。此模型通过了立体化学、残基能量分布以及残基包装等特性的评估,具有很高的可信度。因此可以知道,NK成熟肽主要由12个β折叠和6个α螺旋构成。内部结构域主要由6个β折叠片组成的折叠桶和2个α螺旋构成。基于此模型结构,NK的最适底物H-D-VLK-pNA被对接到了NK的活性中心。分析此底物和NK分子活性中心的相互作用,发现NK对此最适底物的结合位点应该是五个位点(G102,Y104,I107,G127和E156)。进一步分析此底物和NK分子活性中心残基之间的氢键相互作用,提出了一个不同于经典教科书上的丝氨酸蛋白酶催化理论的新机理。该机理更强调微碱性环境中的[OH]作为亲核试剂的可能性,而经典的理论强调是S221作为亲核试剂水解肽键。
进一步研究了NK活性中心附近的氢键对催化三联体(D32,H64,S221)以及羟基阴离子洞(N155)的重要性。经过对NK分子模型的深入分析,我们发现在NK分子活性中心周围有四个位点(S33,D60,S62,和T220)是非常重要的。首先利用分子生物学技术,将这四个位点分别突变成丙氨酸。然后用酶动力学方法求出了这些突变体的酶动力学常数。和野生型的酶动力学常数相比较,发现这四个位点主要是对酶的催化起贡献,而对于酶和底物的结合贡献不大。进一步对这四个位点进行自由能扰动(freeenergyperturbation,FEP)的计算,结果也证明了这四个位点主要是对酶的催化起贡献。而分子动力学的结果更从微观上分析了这4个位点对NK活性中心结构稳定性的影响。最后得出结论,4个位点的突变将部分释放出D32,H64和N155,使得它们能自由的扰动,而偏离了正常的活性位置,从而导致了酶的活力降低。
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