苦荞FtADH1与FtPMEI13基因鉴定及其抗旱分子机制的研究

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近年来,苦荞作为优质的小杂粮作物,其种植面积和产量显著提升,而随时间的推移,全球土地的干旱沙漠化成为作物生产的限制因素,干旱胁迫是干旱、半干旱地区苦荞减产的重要因素,因此提高苦荞对干旱胁迫的耐受性是苦荞生产发展的迫切需要。本试验将290份苦荞种质资源进行芽期干旱处理,分析相对发芽率、发芽势、发芽指数和苗全长指标,评价不同材料的抗旱等级。对290份材料重测序,使用总隶属函数值和抗旱指数结合基因型进行全基因组关联分析,定位与干旱相关的显著独立单核苷酸多态性(SNP)位点,根据SNP位点挖掘到2个抗旱候选基因。本研究从品苦1号c DNA中克隆到乙醇脱氢酶基因(Alcohol dehydrogenase,FtADH1)与果胶甲基酯酶抑制剂(Pectin methylesterase inhibitor,FtPMEI13),并构建p CAMBIA1302过表达载体,异源表达拟南芥及遗传转化苦荞外植体,分析逆境胁迫下基因表达特性、检测抗旱相关生理指标以及鉴定抗旱相关表型,评价转基因株系的抗旱性,初步解析了FtADH1与FtPMEI13基因参与苦荞抗旱的分子机理。主要研究结果如下:1.290份材料隶属函数值呈现正态分布,不同材料表现出不同的抗旱能力,共分为5个抗旱级别,筛选出极强抗旱材料29份。2.通过抗旱指数和总隶属函数进行全基因组关联分析,挖掘到8号染色体上一个与抗旱性显著相关的候选位点,对其上下游400 kb区段分析,共挖掘到28个候选基因。苦荞无菌苗经5%与10%PEG6000诱导1、3、6 h,q RT-PCR检测到11个上调表达基因,并且发现FtADH1与FtPMEI13在ABA诱导后呈现与PEG6000诱导后一样的变化趋势;同时,我们检测到FtADH1在基因上游有3个差异显著的SNP位点;在外显子上有1个SNP位点,使得Ala突变为Gly,造成非同义突变;并且该基因在抗旱级别高的材料中表达量高,在抗旱级别低的材料中,表达量低。FtPMEI13在外显子上有2个SNP位点,但均为同义突变;在基因上游检测到一个碱基A的插入,该碱基的插入破坏了核心元件CAAT box;同时,发现该基因在不同抗旱级别材料中表达量也呈现较大差异。3.已克隆鉴定的FtADH1基因:系统进化分析显示与甜荞、甜菜、拟南芥和大豆亲缘关系较近。苦荞全生育期q RT-PCR结果分析表明,FtADH1主要在根和茎中表达。构建p CAMBIA1302-FtADH1过表达载体,异源表达拟南芥与遗传转化苦荞外植体。在甘露醇处理下,拟南芥FtADH1过表达株系中发芽率与根长都高于对照,离体叶片失水率低于对照;反复干旱苗期拟南芥,发现转基因株系比1302空载株系更加抗旱;干旱后,与对照相比,转基因株系抗氧化酶活性提高,ROS含量降低。PEG6000处理毛状根发现,过表达根系中FtADH1基因表达量显著高于对照;且FtADH1过表达根系的CAT、POD和SOD酶活性提升,MDA含量下降。4.已克隆鉴定的FtPMEI13基因:系统进化分析显示与甜荞、甜菜和拟南芥亲缘关系较近。苦荞全生育期q RT-PCR结果分析表明,FtPMEI13主要在茎和叶中表达。构建p CAMBIA1302-FtPMEI13过表达载体,异源表达拟南芥与遗传转化苦荞外植体。在甘露醇处理下,拟南芥FtPMEI13过表达株系中发芽率与根长都高于对照,离体叶片失水率低于对照;通过反复干旱的方法,发现对照株系萎蔫严重,而转基因株系抗旱能力增强;干旱处理后,转基因株系抗氧化酶活性提高,ROS含量降低。PEG6000处理毛状根发现,FtPMEI13转基因根系中,FtPMEI13基因表达量显著高于对照,且CAT、POD、SOD酶活性提升,MDA含量下降。综上所述,本研究对290份苦荞材料抗旱性与基因型进行全基因组关联分析,挖掘到2个抗旱候选基因,并将这两个候选基因异源表达拟南芥和遗传转化苦荞外植体进行了功能初步验证,为深入解析苦荞抗旱分子机理奠定了基础。
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