84K杨PagPIP1;2基因的克隆、表达与生理功能研究

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干旱是限制我国北方地区森林生产力的主导因子,未来全球气候变化下干旱程度可能会加剧。树木叶片水分利用效率是表征蒸腾耗水与光合固碳关系的重要性状。提高叶片水分利用效率对干旱环境下树木的适应和存活有重要意义。水通道蛋白(aquaporin,AQPs)又称水孔蛋白,属于膜内嵌蛋白超家族(major intrinsic proteins,MIPs),能特异性双向透过水分子以及CO2等小分子,参与水分吸收运输等多项生理过程。其中透过CO2的水通道蛋白有可能通过增大叶肉CO2导度进而提高叶片水分利用效率。本研究依据已知的毛果杨(Populus trichocarpa)PIP1;2的基因序列,从84K杨(P.abla×P.glandulosa)中克隆得到PagPIP1;2基因的c DNA序列,并分别构建35S::PIP1;2和35S::PIP1;2-e GFP过表达载体;通过相关软件对PagPIP1;2蛋白的氨基酸序列、三维结构及细胞定位进行了分析;通过转基因技术获得了该基因的拟南芥(Arabidopsis thaliana)和烟草(Nicotiana tabacum)过表达株系,验证了其亚细胞定位,并研究了过表达PagPIP1;2基因对拟南芥和烟草抗旱性的影响。主要研究结果如下:1.PagPIP1;2水通道蛋白由288个氨基酸组成,理论等电点(p I)为8.83,不稳定系数24.52,平均亲水系数0.377,脂质系数96.25,含有典型的pfam00230保守结构域,属于MIP家族成员,主要存在于细胞质膜与内质网上,为典型的PIP水通道蛋白基因,主要由α-螺旋、延长链、β-螺旋与无规则卷曲组成,呈四聚体结构。PagPIP1;2水通道氨基酸序列高度保守,蛋白分化程度较低。2.激光共聚焦显微镜观察到p CM1300-PIP1;2-GFP载体可在本氏烟草(N.benthamiana)叶片表皮的细胞膜和叶肉细胞的叶绿体膜上瞬时表达;过表达PagPIP1;2-GFP烟草株系中,PagPIP1;2蛋白定位于根毛和根表皮的细胞膜、茎皮层细胞的细胞膜、叶绿体膜以及核膜。3.全光照条件下(24 h光照),正常供水的烟草过表达株系与野生型的生长状况无显著差异;过表达株系气孔导度(Gs)、胞间CO2浓度(Ci)显著降低,瞬时水分利用效率提高,而净光合速率(Pn)降低;叶绿素荧光与野生型无显著差异;干旱胁迫下过表达株系的生长状况显著高于野生型,表明过表达PagPIP1;2基因有利于烟草减弱蒸腾速率及维持光合能力,并调节根、茎和叶的碳投资,提高整株抗旱性。光暗循环条件下(16h光/8h暗),干旱处理的烟草过表达株系的叶片可溶性糖含量、电子传递速率(ETR)、叶面积和器官干重等生长数显著高于野生型,且根冠比增大有利于植株水分平衡。4.正常供水的拟南芥过表达株系的单叶面积和莲座直径增大,叶片数增多,地上部干重、总干重显著增加;干旱处理下,过表达株系的生长状况和根冠比显著高于野生型,有利于其根系吸水并增强抗旱性。综上所述,84K杨PIP1;2是典型的PIP1水通道蛋白,过表达PagPIP1;2基因有利于植物叶片非结构性碳(NSC)积累,通过调节叶肉导度减低气孔开度从而减弱蒸腾耗水,并因此增强了叶片水分利用效率,以及植株抗旱性的显著提高。
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