论文部分内容阅读
猪圆环病毒(Porcine Circovirus,PCV)最初被认为是猪。肾传代细胞系PK15的一种非致病性污染物。目前已知PCV分为两个血清型:PCV1和PCV2,两者都属于圆环病毒属。断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)于1991年首先发现于加拿大西部,给世界各地的养猪业带来了严重的经济损失。PCV2是引起PMWS的主要病原微生物之一,而与之遗传相关的PCV1虽然广泛存在于动物体内但却被认为不能对动物产生致病性。本研究通过PCR方法克隆到1株PCV1杭州分离株的全基因组,并在此基础上对其主要功能蛋白的相互作用进行了研究,主要研究结果如下:
将疑似PMWS病猪淋巴结、脾脏、肝脏等器官的组织样品经液氮速冻后,研磨粉碎,用蛋白酶K法提取基因组DNA。根据已发表的PCVI序列(GenBank登录号:U49186)设计特异性引物扩增PCVl的全基因组,并将其克隆入pGEM-Teasy载体进行测序。测序结果表明这株PCV1基因组的全长为1759bp,与GenBank中发表的其它30株PCV1相比,基因组同源性为98.6％～99.8％;与60株PCV2相比,同源性仅为76.8％～78.0％。将其命名为HZ2006,登录GenBank,登录号为:EF533941。
对GenBank中迄今发表的全部31株PCV1、部分PCV2(60株)以及其它10株圆环病毒科病毒进行生物信息学分析。PCVs间亲缘关系分析结果表明:PCV1与PCV2在很大程度上来自于同一个祖先;PCV1株间遗传与分子进化分析结果表明:PCV1可分为基因Ⅰ型与基因Ⅱ型两种基因型;PCV1与PCV2之间基因组结构和功能区分析结果表明:PCVs基因组之间在复制起始区等功能区高度保守,在主要的编码区,尤其是编码cap蛋白的ORF2,存在不少差异。
设计特异性引物扩增PCV1-cap、PCV1-rep以及PCV2-cap的基因片段。分别将它们克隆入酵母双杂交载体pGADT7和pGBKT7中,构建“prey”载体pGADT7-PCV1-cap、pGADT7-PCV1-rep和pGADT7-PCV2-cap以及“bait”载体pGBKT7-PCV1-cap。应用醋酸锂的方法将“prey”载体转化到酵母细胞AH109中,在SD/-Leu选择培养基上培养;将“bait”载体转化到酵母细胞AH109中,在SD/-Trp选择培养基上培养。将“prey”载体pGADT7-PCV1-cap、pGADT7-PCV1-rep和pGADT7-PCV2-cap分别与空“bait”载体pGBKT7以及“bait”载体pGBKT7-PCV1-cap与空“prey”载体pGADT7共同转化酵母细胞,在SD/-Trp-Leu-Ade-His选择培养基上培养。结果表明:所构建的4个重组质粒均可以在酵母细胞体内表达,对酵母细胞无毒性作用,亦无自身激活活性,可以作为酵母双杂交体系中的“prey”载体和“bait”载体,用于双杂交实验,检测蛋白-蛋白之间的相互作用。
将构建好的“Bait”质粒pGBKT7-PCV1-cap转入酵母细胞AH109中。用含有“Bait”质粒的酵母细胞制备感受态,然后分别将“Prey”质粒pGADT7-PCV1-cap、pGADT7-PCV1-rep、pGADT7-PCV2-cap转入含有“Bait”质粒的酵母细胞AH109中。双杂交实验和β-半乳糖苷酶活性检测证实在酵母体内pGBKT7-PCV1-cap与pGADT7-PCV1-rep、pGBKT7-PCV1-cap与pGADT7-PCV2-cap发生了相互作用,而pGBKT7-PCV1-cap与pGADT7-PCV1-cap则没有发生相互作用。
本研究从浙江省疑似PMWS的一个猪场中成功分离到一株PCV1,并对其全基因组进行了克隆、测序及生物信息学分析。通过酵母双杂交系统,特异性检测到了PCVs主要功能蛋白的相互作用,为深入研究PCV1在动物体内的感染机制以及它在PCV2感染过程所起到的作用奠定了一定的基础。