研究背景:关节软骨是衬附在关节表面的薄层致密结缔组织,其表面光滑,质地坚固而富有弹性,是人体关节重要的负重组织。而正常的关节软骨由于无血管、神经及淋巴分布,损伤后难以自行修复,至今仍然缺乏有效的修复策略。而临床工作中,关节软骨损伤的发生率较高,Widuchowski回顾性分析25,124例膝关节镜手术病例,发现60%病例存在软骨损伤。软骨损伤已成为导致关节疼痛、功能障碍甚至肢体残疾的重要原因。现阶段临床常用的损伤软骨修复策略主要包括:关节腔清理、微骨折、软骨移植、软骨细胞移植、骨软骨移植等,但以上修复策略长期疗效欠佳,治疗效果难以令人满意。软骨组织工程技术是关节软骨损伤修复较为理想的方法,但现阶段组织工程技术用于软骨修复仍存在诸多问题,如:程序较复杂;修复组织力学属性较差、与宿主组织整合欠佳以及纤维软骨退变等。因此,探索更为简便且具有更优修复效果的软骨组织工程策略具有重要意义。因此,为了简化操作程序同时提高损伤软骨修复效果,我们提出了氧化透明质酸-Ⅱ型胶原仿生凝胶复合自体浓缩骨髓有核细胞,一步法修复猪膝关节软骨缺损的修复策略。透明质酸、Ⅱ型胶原蛋白均为正常软骨细胞外基质的主要组成部分,因此通过透明质酸、Ⅱ型胶原蛋白构建仿生凝胶。再将该仿生凝胶与自体浓缩骨髓有核细胞混合,通过一步注射法接种于软骨缺损区域。在关节腔独特的生长微环境下,自体浓缩骨髓有核细胞中的间充质干细胞进行成软骨分化,分泌新生软骨细胞外基质,从而起到损伤软骨修复的效益。在本研究中,我们通过体外实验及大动物实验验证该治疗策略的有效性及安全性。以贵州小香猪为实验动物,行股骨滑车软骨缺损造模,一步法植入混合自体浓缩骨髓有核细胞的氧化透明质酸-Ⅱ型胶原仿生凝胶,氧化透明质酸和Ⅱ型胶原蛋白通过Schiff’s base反应产生化学交联。术后1、3及6月通过MRI、大体观察及组织学分析评估其对损伤软骨的修复效果。通过本研究探索该策略的可行性及有效性,以及其临床运用潜能。研究内容:第一部分氧化透明质酸-Ⅱ型胶原仿生凝胶的制备及体外研究本部分研究中,以新鲜正常猪膝关节透明软骨为原材料,通过胃蛋白酶消化法提取Ⅱ型胶原蛋白水凝胶,利用SDS-PAGE电泳对其进行鉴定。同时制备氧化透明质酸,并对其进行鉴定及毒性检测。将Ⅱ型胶原蛋白与自体浓缩骨髓有核细胞混合,加入氧化透明质酸,Ⅱ型胶原蛋白可与氧化透明质酸通过Schiff’s base反应产生化学交联,成凝胶反应,从而构建氧化透明质酸-Ⅱ型胶原仿生凝胶自体浓缩骨髓有核细胞复合物。通过对该复合物进行体外培养,初步验证该策略的可行性:一、猪膝关节透明软骨Ⅱ型胶原蛋白水凝胶的提取制备1.干燥软骨粉的获取⑴获取新鲜贵州小香猪膝关节透明软骨;⑵真空冷冻干燥机中冷冻干燥透明软骨;⑶液氮低温粉碎机,将软骨片粉碎成干燥软骨粉。2.Ⅱ型胶原蛋白的提取⑴盐酸胍初步消化透明软骨;⑵胃蛋白酶消化,Ⅱ型胶原蛋白盐析及透析。二、猪软骨Ⅱ型胶原蛋白水凝胶的鉴定1.SDS-PAGE电泳对所提蛋白的分子量及纯度进行测定;2.通过摇菌培养进行Ⅱ型胶原水凝胶的无菌鉴定;三、透明质酸的氧化、鉴定及毒性检测1.高碘酸钠氧化透明质酸;2.氧化透明质酸冷冻干燥;3.氧化透明质酸傅立叶红外光谱分析;4.氧化透明质酸CCK-8细胞毒性分析。四、氧化透明质酸-Ⅱ型胶原水凝胶体外成胶及复合骨髓间充质干细胞培养1.骨髓间充质干细胞的获取与鉴定⑴抽取贵州小香猪髂骨骨髓;⑵Percoll密度梯度离心法获取自体浓缩骨髓有核细胞;⑶从自体浓缩骨髓有核细胞中分离、培养及扩增骨髓间充质干细胞;⑷对分离培养的骨髓间充质干细胞进行成骨、成软骨及成脂三系诱导培养,对其分化能力进行鉴定。2.氧化透明质酸-Ⅱ型胶原水凝胶体外成胶及检测⑴氧化透明质酸-Ⅱ型胶原水凝胶体外成胶;⑵凝胶体外冻干;⑶冻干凝胶扫描电镜观察;⑷体外培养观察溶胀及溶解。3.复合骨髓间充质干细胞培养及鉴定⑴氧化透明质酸-Ⅱ型胶原水凝胶复合骨髓间充质干细胞;⑵体外培养14、21天后取材;⑶HE染色及扫描电镜观察。五、实验结果SDS-PAGE电泳提示制备的水凝胶主要成分为Ⅱ型胶原蛋白,高碘酸钠氧化制备的氧化透明质酸无明显细胞毒性。通过加入氧化透明质酸,氧化透明质酸-Ⅱ型胶原蛋白水凝胶具有良好的成胶性。Percoll密度梯度离心法可有效分离猪自体浓缩骨髓有核细胞复合物,通过贴壁法分离骨髓间充质干细胞,体外三系诱导实验提示该细胞具有良好的成骨、成软骨及成脂分化特性。氧化透明质酸-Ⅱ型胶原仿生凝胶复合骨髓间充质干细胞体外培养提示:种子细胞在复合物内部呈圆形的软骨细胞样形态,细胞密度无明显改变,复合物无降解发生。实验结果提示该仿生凝胶具有良好的细胞相容性。第二部分仿生凝胶复合干细胞修复软骨缺损动物实验本部分研究中,设计了一步法修复软骨缺损的动物实验,通过仿生凝胶复合自体浓缩骨髓有核细胞修复猪膝关节软骨缺损。以贵州小香猪为实验动物,首先在全麻下于髂脊处抽吸获取骨髓,通过骨髓分离液分离获取自体浓缩骨髓有核细胞,并和Ⅱ型胶原蛋白混合,加入氧化透明质酸作为交联剂。通过手术方式于膝关节股骨滑车处制备直径为8 mm的全厚软骨缺损模型,将混合细胞的水凝胶植入软骨缺损部位。术后1、3、6月通过MRI扫描、大体观察、体视显微镜及病理切片进行观察分析。通过本部分动物实验,探索该策略对软骨缺损的修复效果,验证该策略的有效性及可行性:一、动物实验分组1.将40头贵州小香猪按随机数表法分配为对照组(A组)、实验组(B组),避免手术后膝关节出现继发性损伤,每只动物只做单膝,每组20膝,共40膝;2.其中A组即空白对照组(只做全层透明软骨缺损,不做修复);B组即实验组(全层透明软骨缺损后氧化透明质酸-Ⅱ型胶原蛋白仿生凝胶复合骨髓浓缩细胞修复);3.每组膝关节于3个时间点(术后1、3及6月)取材进行观察、分析、评价,每个取材时间点5个膝关节样本。二、Ⅱ型胶原仿生凝胶自体浓缩骨髓有核细胞复合物的制备1.抽取贵州小香猪髂骨骨髓;2.采用Percoll密度梯度离心法获取自体浓缩骨髓有核细胞;3.自体浓缩骨髓有核细胞与调中性Ⅱ型胶原蛋白水凝胶混合均匀。三、动物手术1.于股骨髁滑车处制备8 mm直径全厚软骨缺损模型;2.按比例将氧化透明质酸加入Ⅱ型胶原-自体浓缩骨髓有核细胞复合物,调匀植入软骨缺损处成凝胶后逐层关闭手术切口。四、软骨修复效果检测1.MRI扫描,观察软骨损伤修复效果,采用改良软骨修复组织MRI观察评分系统进行评分;2.标本的大体观察:观察关节腔内有无积液;关节滑膜有无水肿增生;髌股关节面有无变形、脱位;软骨面有无磨损;剖面观软骨修复平整度及软骨下骨情况;3.取材、固定:10%中性福尔马林组织固定、EDTA脱钙液脱钙;4.切片、染色:行固绿-番红O染色、Masson三色染色、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色及天狼星红染色;5.显微镜观察,并进行改良ICRS组织学评分、改良O’Driscoll组织学评分;6.通过Y染色体荧光原位杂交技术对植入种子细胞进行细胞成像,对植入的种子细胞进行示踪。五、实验结果MRI评分、大体观察及病理分析均提示治疗组较空白对照组具有更优的软骨损伤修复效果。治疗组在修复组织内细胞分布、修复组织表面平整度、与邻近正常软骨的整合程度、Ⅱ型胶原蛋白含量、GAG含量、钙化软骨层及软骨下骨形态等方面均明显优于空白对照组。细胞示踪成像实验,提示植入的种子细胞在术后存留于软骨缺损区域,且具有自我更新能力,参与软骨缺损修复。结论:通过本研究,发现自体浓缩骨髓有核细胞复合Ⅱ型胶原蛋白-氧化透明质酸仿生水凝胶对全厚软骨缺损具有良好的修复效果,修复组织呈透明软骨样。植入的自体浓缩骨髓有核细胞具有自我更新及成软骨分化潜能,参与软骨缺损修复。